Translation och proteinsyntes

Translation är den energikrävande och höggradigt reglerade process där ribosomen avkodar mRNA med hjälp av aminoacylerade tRNA och syntetiserar en polypeptid med definierad aminosyrasekvens. För att bli biologiskt aktiv måste den nybildade kedjan dessutom sorteras, veckas, modifieras och genomgå kvalitetskontroll.

Proteinsyntesens omfattning och cellulära organisation

I snäv bemärkelse avser proteinsyntes translation av moget mRNA till en polypeptid. I funktionell mening omfattar processen även aminoacylering av tRNA, ribosomal avkodning, veckning, intracellulär sortering, kovalenta modifieringar, proteolytisk mognad och kvalitetskontroll. Informationsflödet följer i regel DNA → RNA → protein: DNA-sekvensen transkriberas till RNA, medan mRNA:s nukleotidsekvens bestämmer polypeptidens primärstruktur. Proteiner används däremot inte som mall för sekvensöverföring tillbaka till nukleinsyra.

Hos eukaryoter sker transkription och huvuddelen av pre-mRNA-mognaden i cellkärnan. Efter 5′-capping, splitsning och 3′-polyadenylering exporteras moget mRNA genom kärnporerna till cytoplasman. Translationen sker där på fria ribosomer eller på ribosomer som genom den nascenta polypeptidens signalsekvens rekryterats till endoplasmatiskt retikel, ER. Ribosomerna är strukturellt likvärdiga; deras lokalisering bestäms av det protein som för tillfället syntetiseras.

Prokaryoter saknar kärnmembran, vilket gör att ribosomer kan börja translatera ett mRNA innan RNA-polymeraset har avslutat transkriptionen. Flera ribosomer kan samtidigt läsa samma mRNA och bilda en polysom eller polyribosom. Även i eukaryoter är polysomer vanliga, men transkription och translation är rumsligt separerade.

mRNA, läsram och den genetiska koden

Ribosomen förflyttar sig längs mRNA i riktningen 5′→3′ och läser sekvensen som konsekutiva, icke-överlappande tripletter. Den position där avkodningen börjar definierar läsramen; samma RNA-sekvens har därför tre möjliga läsramar i vardera riktningen, men endast den biologiskt valda ramen ger det avsedda proteinet. Den kodande regionen, open reading frame, sträcker sig från ett startkodon till ett stoppkodon i samma ram.

Koden är degenererad: flera synonyma kodon kan ange samma aminosyra. Metionin och tryptofan har vardera ett kodon, medan exempelvis serin har sex. Synonyma kodon används inte lika ofta. Kodonpreferens påverkas av genomets sammansättning, uttrycksnivå och tillgången på motsvarande tRNA och kan därmed påverka translationshastighet, ribosompauser och kotranslationell veckning.

Koden är nästan universell men inte absolut. Mitokondrier och vissa mikroorganismer använder avvikande kodontolkning; ett kodon som är stoppkodon i den cytosoliska koden kan där ange en aminosyra. En missensemutation byter aminosyra, en nonsensemutation skapar ett prematurt stoppkodon och en insertion eller deletion som inte är delbar med tre orsakar läsramsförskjutning. Läsramsmutationer ändrar vanligen hela den efterföljande aminosyrasekvensen och ger ofta ett tidigt stopp.

Ribosomens struktur, katalytiska centra och biogenes

Ribosomen är ett ribonukleoproteinkomplex med en liten och en stor subenhet. Den lilla subenheten binder mRNA och innehåller avkodningscentrum, där kodon–antikodon-geometrin granskas. Den stora subenheten innehåller peptidyltransferascentrum och en utgångstunnel genom vilken den nascenta polypeptiden passerar.

Svedbergenheten S anger sedimentationsbeteende och påverkas av massa, form och densitet. Den är därför inte additiv: 30S och 50S bildar 70S, inte 80S. Skillnaderna mellan bakteriella och eukaryota ribosomer möjliggör selektiv antibiotikabehandling, men likheten mellan bakterieribosomer och mitokondriella ribosomer bidrar samtidigt till läkemedelstoxicitet.

A-sätet tar emot inkommande aminoacyl-tRNA, P-sätet håller tRNA som bär den växande peptidkedjan och E-sätet tar tillfälligt emot deacylerat tRNA före avgång. Peptidyltransferasaktiviteten är huvudsakligen rRNA-baserad; ribosomen är således ett ribozym. Bakteriella subenheter sätts samman i cytoplasman, medan eukaryot ribosombiogenes börjar i nukleolen och kräver bearbetning av pre-rRNA, ribosomala proteiner, snoRNP-komplex och ett stort antal monteringsfaktorer.

tRNA som adaptor: struktur, isoacceptorer och wobble

tRNA är vanligen cirka 70–90 nukleotider långt. Sekundärstrukturen liknar ett klöverblad, medan tertiärstrukturen är L-formad. Acceptorstammen avslutas med den universella sekvensen 3′-CCA; aminosyran binds som en ester till det terminala adenosinet. I den motsatta delen av L-formen finns antikodonloopen.

D-loopen innehåller ofta dihydrouridin, och TΨC-loopen innehåller bland annat pseudouridin, Ψ. Den variabla loopen varierar i längd mellan olika tRNA. Modifierade baser stabiliserar strukturen, styr interaktioner med syntetaser och ribosom samt finjusterar kodonavläsningen. Isoacceptor-tRNA har olika antikodon men laddas med samma aminosyra.

Kodon och antikodon binder antiparallellt. De två första kodonpositionerna avläses vanligen strikt, medan den tredje kan tillåta wobbleparning. Inosin i antikodonet kan exempelvis para med flera olika baser. Därmed kan en begränsad tRNA-uppsättning avkoda 61 sensekodon. Defekter i tRNA-modifierande enzymer kan öka felläsning, frameshifting eller ribosompauser och är särskilt betydelsefulla i vävnader med höga krav på mitokondriell translation.

Aminoacylering av tRNA och korrektur

Aminoacyl-tRNA-syntetaser etablerar den kemiska kopplingen mellan en aminosyra och rätt tRNA. Först reagerar aminosyran med ATP och bildar enzymbundet aminoacyl-AMP samt pyrofosfat, PPi. Därefter överförs aminoacylgruppen till 2′- eller 3′-OH-gruppen på det terminala adenosinet i tRNA:s CCA-ände. Hydrolys av PPi driver reaktionen framåt.

ATP omvandlas till AMP, vilket motsvarar förbrukning av två energirika fosfatbindningar. Den resulterande esterbindningen lagrar energi som senare används vid peptidbindningsbildningen. Aminoacyl-tRNA-syntetaser delas strukturellt i klass I och II och känner igen en kombination av aminosyrans egenskaper och identitetselement i tRNA, exempelvis antikodon, acceptorstam och särskilda baspar.

Fideliteten förstärks genom pre-transfer editing, där felaktigt aktiverat aminoacyl-AMP hydrolyseras, och post-transfer editing, där ett felladdat tRNA avacetyleras. Syntetaser måste bland annat skilja mellan aminosyror med mycket likartade sidokedjor. Ribosomen kontrollerar främst kodon–antikodonpassningen och kan inte avgöra om ett korrekt tRNA bär fel aminosyra; felladdning kringgår därför ribosomens avkodningskontroll. Den sammanlagda translationsfelfrekvensen är i storleksordningen 10⁻⁴ per inkorporerad aminosyra.

Initiering av translation

I bakterier basparar den purinrika Shine–Dalgarno-sekvensen uppströms om startkodonet med en komplementär sekvens i 16S rRNA. Därmed placeras AUG i P-sätet. IF3 håller 30S- och 50S-subenheterna åtskilda, IF1 blockerar A-sätet och IF2–GTP levererar initiator-tRNA laddat med N-formylmetionin, fMet-tRNA^fMet. Efter korrekt startkodonigenkänning hydrolyserar IF2 GTP och 50S ansluter.

Hos eukaryoter bildar 40S-subenheten tillsammans med eIF1, eIF1A, eIF3 och ternärkomplexet eIF2–GTP–Met-tRNA_i ett 43S-preinitieringskomplex. eIF4F-komplexet består av capbindande eIF4E, helikaset eIF4A och scaffoldproteinet eIF4G. Det rekryterar komplexet till 5′-cap, varefter ribosomen scannar 5′-UTR. En purin vid position −3 och G vid +4 gynnar start i en optimal Kozak-kontext.

Startigenkänning utlöser GTP-hydrolys på eIF2, frisättning av initieringsfaktorer och eIF5B-medierad anslutning av 60S. Initiator-tRNA är strukturellt och funktionellt skilt från elongator-tRNA för metionin och placeras direkt i P-sätet. Reglerade avvikelser omfattar leaky scanning förbi ett svagt AUG, upstream open reading frames, initiering vid icke-AUG-kodon och capoberoende rekrytering via internal ribosome entry sites, IRES.

Elongering: avkodning, peptidbindning och translokation

Varje elongeringscykel börjar när EF-Tu–GTP i bakterier, eller eEF1A–GTP i eukaryoter, levererar ett aminoacyl-tRNA till A-sätet. Korrekt kodon–antikodonparning stabiliserar avkodningscentrum och stimulerar GTP-hydrolys. Icke-kognata och många nära-kognata tRNA avvisas genom initial selektion och efterföljande kinetiskt korrektur innan full accommodation i peptidyltransferascentrum.

Aminogruppen på A-sätets aminosyra angriper esterbindningen som förenar peptiden med P-sätets tRNA. Peptiden överförs därmed till A-sätets tRNA och förlängs med en aminosyra. Ingen ytterligare ATP behövs för själva peptidbindningen; drivkraften kommer från den energirika esterbindning som skapades vid aminoacyleringen.

EF-G–GTP respektive eEF2–GTP driver därefter translokation med ett kodon. Peptidyl-tRNA flyttas A→P, deacylerat tRNA P→E och lämnar ribosomen, medan A-sätet frigörs. Kedjan växer från N- till C-terminal. Hastigheten är omkring 10–20 aminosyror/s i snabbt växande bakterier och 4–7 aminosyror/s i eukaryota celler. Pauser kan orsakas av sällsynta kodon, låg tillgång på laddat tRNA, stabil mRNA-struktur, polybasiska segment, nascent kedje–tunnelinteraktioner eller skadat mRNA.

Terminering, ribosomåtervinning och omkodning

När UAA, UAG eller UGA når A-sätet finns inget normalt matchande tRNA. I bakterier känner RF1 igen UAA och UAG, medan RF2 känner igen UAA och UGA. Eukaryot eRF1 känner igen samtliga tre. Releasefaktorernas konserverade GGQ-motiv placeras i peptidyltransferascentrum och stimulerar vattenmedierad hydrolys av bindningen mellan polypeptiden och P-sätets tRNA.

RF3 respektive eRF3 är GTPaser som främjar effektiv terminering och faktoromsättning. Efter peptidfrisättning splittrar bakterier ribosomen med ribosome recycling factor, RRF, EF-G och IF3. Hos eukaryoter medverkar ATPaset ABCE1 till att separera 80S-ribosomen och återvinna subenheterna.

Stoppkodonets omgivande sekvens påverkar konkurrensen mellan releasefaktorer och nära-kognata tRNA. Readthrough kan vara fysiologiskt reglerad eller patologiskt ökad. Programmerad ribosomal frameshifting använder särskilda mRNA-signaler och ribosompauser för att byta läsram. Vid selenoproteinsyntes omtolkas UGA som selenocystein genom Sec-tRNA^Sec, specialiserade elongeringsfaktorer och ett SECIS-element; UGA är då inte ett vanligt stopp i den aktuella kontexten.

Energetik, polysomer och reglering av translationshastigheten

För varje tillagd aminosyra förbrukas normalt två energirika fosfatbindningar när ATP klyvs till AMP och PPi vid aminoacylering. Därtill hydrolyseras vanligen ett GTP vid aminoacyl-tRNA-leverans och ett vid translokation. Den direkta kostnaden blir således cirka fyra energirika fosfatbindningar per elongeringssteg, utöver energi till initiering, terminering, ribosombiogenes, chaperoner och kvalitetskontroll.

Flera ribosomer kan samtidigt translatera samma mRNA. Polysomens ribosomtäthet bestäms av förhållandet mellan initieringsfrekvens och elongationshastighet. Hög täthet ökar produktionskapaciteten men kan också orsaka ribosomköer och kollisioner. Initiering är ofta det hastighetsbegränsande steget och utgör därför en central regleringspunkt.

mTORC1 stimulerar under näringsrika förhållanden bland annat capberoende translation och ribosombiogenes. Aminosyrabrist, hypoxi, virusinfektion eller ER-stress kan via olika kinaser fosforylera eIF2α och minska tillgången på eIF2–GTP–Met-tRNA_i. I bakterier leder aminosyrabrist till stringent response med alarmonerna (p)ppGpp, vilket omfördelar resurser från tillväxt och ribosomproduktion till stressanpassning. Även mRNA-struktur, kodonpreferens och nivån av laddade tRNA påverkar flödet.

Kotranslationell sortering och membrantranslokation

Proteiner utan signalsekvens färdigställs vanligen på fria cytosoliska ribosomer. De kan förbli i cytosolen eller importeras posttranslationellt till exempelvis kärna, mitokondrier eller peroxisomer. Kärnimport styrs av nukleära lokaliseringssignaler och importiner, medan mitokondrie- och peroxisomimport använder separata receptorer och translokationssystem.

Sekretoriska proteiner och många membranproteiner har en N-terminal hydrofob signalsekvens. När den lämnar ribosomens utgångstunnel binder signal recognition particle, SRP, vilket tillfälligt bromsar elongeringen. Komplexet dockar till SRP-receptorn i ER-membranet hos eukaryoter eller plasmamembranet hos bakterier. Ribosomen överförs till Sec61- respektive SecY-translokonet, varefter translation och translokation fortsätter kopplat.

En klyvbar signalsekvens leder ofta till fullständig translokation till ER-lumen. Stop-transfer-sekvenser stoppar passagen och bildar transmembrana segment, medan signal-anchor-sekvenser både initierar membraninsertion och förankrar proteinet. Segmentens orientering och laddningsfördelning påverkar topologin. Defekta sorteringssignaler kan orsaka retention, degradering eller lokalisering till fel organell och därigenom enzymbrist eller toxicitet.

Kotranslationell veckning och molekylära chaperoner

Veckningen börjar ofta innan translationen är avslutad. Utgångstunneln rymmer den utsträckta kedjan och kan tillåta tidig helixbildning, men större tertiära strukturer bildas först utanför ribosomen. Den hydrofoba effekten driver opolära sidokedjor mot proteinets inre, medan vätebindningar, van der Waals-krafter, joninteraktioner och ibland disulfidbindningar stabiliserar strukturen.

I bakterier binder trigger factor nära utgångstunneln och skyddar exponerade hydrofoba segment. Hsp70-systemet använder ATP-drivna cykler för upprepad bindning och frisättning av nascenta eller felveckade kedjor. GroEL/GroES kapslar in bakteriella substrat i en skyddad veckningskammare. Den eukaryota chaperoninen TRiC/CCT hjälper bland annat till med veckning av aktin och tubulin.

I ER katalyserar protein-disulfidisomeras bildning och omarrangering av disulfidbindningar. Calnexin–calreticulin-cykeln binder monoglukosylerade N-glykaner och håller ofullständigt veckade glykoproteiner kvar för nya veckningsförsök. Chaperoner skyddar intermediärer och minskar aggregation, men anger inte proteinets slutliga struktur; den bestäms i grunden av aminosyrasekvensen och den kemiska miljön.

Posttranslationella modifieringar och proteolytisk mognad

Kovalenta modifieringar kan förändra laddning, konformation, bindningsytor, lokalisering eller stabilitet. Många är reversibla och fungerar som reglerande signaler. Andra är permanenta delar av proteinets mognad.

N-glykosylering och N-myristoylering kan börja kotranslationellt och är därför inte strikt posttranslationella. Fosforylering regleras av kinaser och fosfataser. Ubiquitin och SUMO konjugeras genom E1-, E2- och E3-system. γ-karboxylering är vitamin K-beroende och nödvändig för flera koagulationsfaktorers kalciumbindning; vitamin K-antagonister minskar denna mognad.

Proteolys är irreversibel. Signalpeptider avlägsnas vid translokation, och zymogener aktiveras genom specifik klyvning. Preproinsulin förlorar först sin signalsekvens till proinsulin. Efter disulfidbildning klyver prohormonkonvertaser bort C-peptiden, varefter moget insulin består av A- och B-kedjor sammanhållna av disulfidbindningar. Modifieringar och proteolys kan därmed styra aktivitet, lokalisering och halveringstid utan att genens kodande sekvens ändras.

Kvalitetskontroll av mRNA, ribosomer och nybildade proteiner

Nonsense-mediated decay, NMD, identifierar många mRNA med prematura stoppkodon och minskar produktionen av trunkerade proteiner. No-go decay aktiveras när ribosomen stannar på grund av exempelvis stark RNA-struktur, skada eller svårtranslaterad sekvens. Non-stop decay riktas mot mRNA som saknar fungerande stoppkodon och där ribosomen fortsätter in i poly(A)-svansen eller till transkriptets slut.

Stannade eller kolliderande ribosomer känns igen av ribosomassocierade sensorer. Ribosome-associated quality control, RQC, splittrar komplexet, frigör eller räddar ribosomsubenheter och ubiquitinerar ofta den ofullständiga polypeptiden. Detta förhindrar att defekta kedjor ackumuleras och binder andra cellulära komponenter.

I ubiquitin–proteasomsystemet aktiverar E1 ubiquitin, E2 konjugerar det och E3-ligaset ger substratspecificitet. Polyubiquitinerade proteiner känns igen av 26S-proteasomen, vars 19S-regulator vecklar ut substratet och matar in det i den proteolytiska 20S-kärnan. Felveckade ER-proteiner kan retrotranslokeras till cytosolen genom ER-associated degradation, ERAD. Större aggregat och skadade organeller avlägsnas främst genom autofagi och lysosomal nedbrytning. När chaperon-, proteasom- och autofagikapaciteten överskrids uppstår proteotoxisk stress och aggregatbildning.

Klinisk och farmakologisk relevans

Missensemutationer kan störa katalys, stabilitet eller interaktioner. Vid sicklecellsjukdom ersätter valin glutamat i β-globinets position 6. Deoxygenerat hemoglobin S polymeriserar, vilket deformerar erytrocyter och orsakar hemolys, mikrovaskulär ocklusion och ischemisk smärta. Nonsense- och läsramsmutationer ger ofta mRNA-nedbrytning via NMD eller trunkerade proteiner.

Ribosomopatier beror på defekter i ribosomproteiner eller biogenesfaktorer och kan ge benmärgssvikt, utvecklingsavvikelser och ökad cancerrisk. Mutationer i cytosoliska eller mitokondriella tRNA, tRNA-modifieringsenzymer och aminoacyl-tRNA-syntetaser kan ge neurologiska, neuromuskulära eller multisystemiska tillstånd. Mitokondriella translationsdefekter drabbar särskilt energikrävande vävnader. Kronisk ER-stress och otillräcklig proteostas bidrar till bland annat diabetes och neurodegenerativa sjukdomar med proteinaggregation.

Antibiotikaselektiviteten är relativ, inte absolut. Mitokondriernas evolutionära släktskap med bakterier förklarar en del biverkningar, särskilt vid långvarig exponering eller genetisk predisposition. Resistens kan uppstå genom målmodifiering, enzymatisk läkemedelsinaktivering, minskad permeabilitet eller efflux. Om proteinsynteshämning blir bakteriostatisk eller baktericid beror på substans, koncentration och organism; aminoglykosider är ett viktigt exempel på ribosomriktade antibiotika som ofta är baktericida.

Källor

• Protein biosynthesis
• Proteinsyntes
• Category:Protein biosynthesis
• Protein biosynthesis
• Bild: File:Cotranskriptionale Translation.svg — Andi schmitt, CC BY-SA 4.0
• Bild: File:Ribosome mRNA translation en.svg — LadyofHats, Public domain
• Bild: File:Codon-Anticodon pairing.svg — Yikrazuul, CC BY-SA 3.0
• Bild: File:Charge tRNA.png — Boumphreyfr, CC BY-SA 3.0