Kofaktorer och koenzymer

Kofaktorer är metalljoner eller organiska molekyler som gör kemiska reaktioner möjliga utanför proteinernas egen katalytiska repertoar. Många koenzymer bildas från B-vitaminer och fungerar som återanvändbara bärare av elektroner eller funktionella grupper. Brist, störd metallhomeostas eller farmakologisk blockad ger därför karakteristiska enzymdefekter med diagnostisk och terapeutisk betydelse.

Begrepp, nomenklatur och avgränsning

En kofaktor är en icke-proteinkomponent som krävs för att ett enzym ska kunna utföra sin biologiska funktion. Kofaktorn kan vara en metalljon, ett metallhaltigt komplex eller en organisk molekyl. Proteinfraktionen utan nödvändig kofaktor kallas apoenzym; det katalytiskt kompletta komplexet av apoenzym och kofaktor kallas holoenzym. Begreppen beskriver funktionell sammansättning, inte hur starkt komponenterna sitter ihop.

En koenzym är en organisk kofaktor. Många, men inte alla, koenzymer härrör från vitaminer. NAD⁺ bildas exempelvis från niacin, FAD från riboflavin och koenzym A från pantotenat, medan S-adenosylmetionin, ubikinon och UDP-socker syntetiseras endogent utan att vara direkta vitaminderivat. Koenzymet förändras kemiskt under reaktionen men återbildas i en annan enzymreaktion och förbrukas därför inte netto över en fullständig metabol cykel.

Gränserna är inte absoluta. FAD är ofta en prostetisk grupp men kan i vissa proteiner binda mindre permanent. Heme är en organisk, metallhaltig prostetisk grupp, medan järn–svavelkluster kan beskrivas som oorganiska eller metallorganiska kofaktorer. ATP är både energibärande kosubstrat och ordinärt substrat, eftersom det omvandlas stökiometriskt till ADP eller AMP. Metalljoner som enbart stabiliserar proteinets struktur kan i bred mening kallas kofaktorer, men bör skiljas från katalytiska metalljoner som direkt deltar i bindningspolarisering, syra–baskemi eller elektronöverföring.

Varför enzymkatalys kräver kofaktorer

Aminosyrornas sidokedjor erbjuder syror, baser, nukleofiler och laddade eller hydrofoba grupper, men deras kemiska repertoar är begränsad. Kofaktorer tillför bland annat reversibla redoxcentra, starka Lewis-syror, stabiliserade karbanjoner och bärare av funktionella grupper. Enzymproteinet skapar samtidigt rätt mikromiljö, orienterar substrat och kofaktor och hindrar oönskade sidoreaktioner.

Redoxkoenzymer överför elektroner vid bestämda potentialer. NAD⁺ tar emot en hydridjon, medan flaviner kan hantera både en och två elektroner. Metalljoner som Zn²⁺ polariserar karbonyl- eller vattenmolekyler och stabiliserar negativ laddning. Mg²⁺ skärmar de negativa laddningarna i ATP och gör det möjligt att orientera fosfatgrupperna för nukleofil attack. PLP och tiaminpyrofosfat bildar reaktiva kovalenta intermediärer där elektronbrist eller negativ laddning delokaliseras över kofaktorns konjugerade system.

De viktigaste katalytiska principerna kan sammanfattas som:

• elektron- eller hydridöverföring genom NAD(P), flaviner, heme och metallcentra
• Lewis-syrakatalys och laddningsstabilisering genom metalljoner
• aktivering av vatten till en mer nukleofil hydroxidjon
• överföring av acyl-, metyl-, fosfat-, sulfat-, amino- och C1-grupper
• tillfällig kovalent bindning mellan kofaktor och substrat
• stabilisering av radikaler eller karbanjoner som annars skulle vara mycket kortlivade.

Kofaktorn förändrar inte reaktionens standardfria energi, ΔG°, eller jämviktskonstant. Den erbjuder en alternativ reaktionsväg med lägre fri aktiveringsenergi, ΔG‡, och påskyndar därför både framåt- och bakåtreaktionen. Om en ogynnsam reaktion drivs av ATP-hydrolys eller NADPH-oxidation beror riktningen på kopplingen mellan reaktionerna och de cellulära koncentrationerna, inte på att enzymet har ändrat den underliggande termodynamiken.

Bindning, omsättning och regenerering

Metalljoner binds vanligen genom koordinationsbindningar till elektronpar hos histidin, cystein, aspartat, glutamat eller vatten. Organiska kofaktorer hålls ofta av vätebindningar, joninteraktioner, van der Waals-krafter och hydrofoba kontakter. Biotin binds däremot kovalent till en lysinrest, lipoamid till en lysinrest och PLP ofta som en Schiffbas till ett aktivt lysin. Bindningsstyrkan uttrycks som dissociationskonstanten (K_d=[E][C]/[EC]); lågt (K_d) innebär hög affinitet.

Om kofaktorn är begränsande finns en blandning av apo- och holoenzym. Den uppmätta maximala hastigheten sjunker då eftersom koncentrationen aktivt enzym minskar. När kofaktorn tillsätts ökar aktiviteten mot ett mättnadsvärde. Bristande kofaktormättnad kan även ändra skenbart (K_m) för substratet genom att substratbindningen endast sker effektivt till holoenzymet eller genom att kofaktorn påverkar enzymets konformation. Ett kinetiskt (K_m) ska inte utan vidare tolkas som ett (K_d), eftersom (K_m) också beror på efterföljande katalytiska hastighetskonstanter.

Kosubstrat förändras stökiometriskt i den enskilda reaktionen. NADH oxideras till NAD⁺ i andningskedjan eller när pyruvat reduceras till laktat. NADPH bildas bland annat i pentosfosfatvägen och används därefter i fettsyresyntes, cytokrom P450-reaktioner och glutationberoende antioxidantförsvar. S-adenosylmetionin lämnar efter metylering S-adenosylhomocystein, som via homocystein och metionin återförs till SAM-poolen med ATP-förbrukning.

Vitamin K illustrerar en mer sluten kofaktorcykel. Reducerat vitamin K oxideras till vitamin K-epoxid när γ-glutamylkarboxylas modifierar målproteiner. Epoxiden reduceras tillbaka genom vitamin K-epoxidreduktas, VKOR. Warfarin hämmar denna återvinning, vilket innebär att ett litet vitaminförråd inte längre kan användas genom upprepade katalytiska cykler.

Redoxkoenzymer från vitamin B2 och B3

Riboflavin, vitamin B2, är prekursor till FMN och FAD. Den katalytiskt aktiva delen är isoalloxazinringen, vars konjugerade elektronsystem kan ta emot antingen en elektron till ett semikinon eller två elektroner och två protoner till en fullständigt reducerad flavin. Detta gör flaviner lämpliga som brygga mellan tvåelektrondonatorer och enelektronacceptorer. FMN ingår bland annat i komplex I, medan FAD finns i succinatdehydrogenas och flera acyl-CoA-dehydrogenaser.

FAD är ofta tätt bundet som prostetisk grupp. I succinatdehydrogenas tar enzymbundet FAD upp två väteekvivalenter när succinat oxideras till fumarat. Elektronerna överförs därefter via järn–svavelcentra till ubikinon, medan FAD återgår till oxiderad form utan att diffundera bort. Den stabiliserbara semikinonformen möjliggör sekventiell enelektronöverföring men innebär också risk för läckage till syre och bildning av reaktiva syreföreningar.

Niacin, vitamin B3, ger upphov till NAD⁺ och NADP⁺. Nikotinamidringen accepterar en hydridjon, motsvarande två elektroner och en proton, vid ringens C4-position. NAD(P) är vanligen ett diffunderande kosubstrat som binder, tar emot eller avger hydrid och lämnar enzymet som NAD(P)H eller NAD(P)⁺. NAD⁺ och NADP⁺ har likartad redoxkemi; den extra fosfatgruppen i NADP⁺ styr främst enzymigenkänningen.

Cellen upprätthåller i regel en relativt oxiderad NAD-pool för att gynna substratoxidation, medan NADPH-poolen hålls mer reducerad för att kunna donera elektroner. Hemolys, hypoxi och mitokondriell dysfunktion kan förändra dessa kvoter och därmed påverka många reaktioner samtidigt.

Tiamin, pantotenat och acylgruppsöverföring

Tiaminpyrofosfat, TPP, bildas från vitamin B1. Tiazoliumringen har ett positivt laddat kväve som underlättar deprotonering vid ett intilliggande kol och bildning av en ylid. Yliden attackerar karbonylkolet i en α-ketosyra. Den negativa laddning som uppkommer efter dekarboxylering delokaliseras i tiazoliumringen, vilket stabiliserar en intermediär som annars skulle vara energetiskt ogynnsam.

TPP används av pyruvatdehydrogenas och α-ketoglutaratdehydrogenas. Dessa flerenzymkomplex kombinerar TPP, lipoamid, koenzym A, FAD och NAD⁺. TPP-enheten dekarboxylerar α-ketosyran; lipoamid tar emot och oxiderar den kvarvarande kolenheten; koenzym A bildar en tioester; FAD återoxiderar lipoamid och NAD⁺ återoxiderar FADH₂. Tiaminbrist hämmar därför flera kopplade steg i aerob energiomsättning. TPP behövs även av transketolas, som överför tvåkolsfragment i pentosfosfatvägen.

Pantotenat, vitamin B5, ingår i koenzym A och i 4′-fosfopantetein. Den senare är kovalent fäst vid acylbärarproteiner i exempelvis fettsyrasyntas. Båda har en terminal tiolgrupp som reagerar med karboxylsyror och bildar tioestrar. Svavel ger sämre resonansstabilisering än syre i motsvarande ester, vilket gör acylgruppen mer överföringsbenägen.

Acetyl-CoA kopplar samman glykolys, β-oxidation, citronsyracykel, ketonkroppsmetabolism och biosyntes. Andra acyl-CoA-föreningar transporterar längre fettsyror eller intermediärer som succinyl-CoA. Energin i tioestern utnyttjas när acylgruppen överförs till en nukleofil acceptor, exempelvis oxaloacetat vid citratbildning.

Pyridoxalfosfat och aminosyrametabolism

Pyridoxal-5′-fosfat, PLP, bildas från vitamin B6. I vilande PLP-beroende enzym sitter aldehydgruppen som en intern aldimine, en Schiffbas med ε-aminogruppen hos en lysinrest. När aminosyrasubstratet binder ersätter dess α-aminogrupp enzymlysinet och bildar en extern aldimine. Denna kovalenta koppling placerar bindningen som ska brytas i rätt orientering mot PLP:s konjugerade pyridinring.

Efter protonabstraktion delokaliseras negativ laddning från substratets α-kol in i PLP-ringen, som fungerar som elektronsänka. Vilken bindning som bryts beror på hur substratet orienteras. Samma grundkemi kan därför ge transaminering, dekarboxylering, racemisering samt β- eller γ-eliminering. Enzymproteinet bestämmer selektiviteten genom att hålla den aktuella bindningen ungefär vinkelrät mot det konjugerade π-systemet.

Vid transaminering övergår PLP till pyridoxaminfosfat efter att ha tagit emot aminogruppen. Aminogruppen överförs sedan till en α-ketosyra, ofta α-ketoglutarat, så att glutamat bildas och PLP regenereras. PLP krävs också för syntes av neurotransmittorer genom aminosyradekarboxylering och för det första steget i hemsyntesen. Ett viktigt undantag är glykogenfosforylas: där används huvudsakligen PLP:s fosfatgrupp i syra–baskatalys, inte aldehydgruppen för Schiffbasbildning med substratet.

Biotin, folat och kobalamin

Biotin fungerar som aktiverad koldioxidbärare i karboxylaser. Det binds kovalent till en lysinrest och bildar biocytin på en rörlig proteindomän. I ett aktivt centrum används ATP för att aktivera bikarbonat, varefter CO₂ binds till biotin. Den biotinbärande armen förflyttar sig sedan till ett annat aktivt centrum där CO₂ överförs till acceptorsubstratet. Pyruvatkarboxylas, acetyl-CoA-karboxylas och propionyl-CoA-karboxylas använder denna princip.

Tetrahydrofolat, THF, härrör från folat och bär C1-enheter i flera oxidationstillstånd: metyl-, metylen-, metenyl-, formyl- och formiminogrupper. 5,10-metylen-THF används av tymidylatsyntas vid bildning av dTMP, medan 10-formyl-THF lämnar kolatomer till purinringen. Folatbrist hämmar därmed DNA-syntes och drabbar framför allt snabbt prolifererande celler, vilket ger megaloblastär hematopoes.

Kobalamin, vitamin B12, innehåller kobolt i en korrinring och kan bilda en ovanlig kobolt–kolbindning. Metylkobalamin används av metioninsyntas för överföring av metylgruppen från 5-metyl-THF till homocystein. Adenosylkobalamin används av metylmalonyl-CoA-mutas, där homolytisk klyvning av kobolt–kolbindningen skapar en radikal som möjliggör omlagring till succinyl-CoA.

Vid B12-brist kan 5-metyl-THF inte effektivt återföras till den övriga folatpoolen, den så kallade folatfällan. Följden blir funktionell folatbrist, megaloblastos och förhöjt homocystein. Samtidigt blockeras metylmalonyl-CoA-mutas, vilket ger förhöjt metylmalonat. Ren folatbrist höjer homocystein men inte metylmalonat, en diagnostiskt viktig skillnad.

Vitamin K, askorbat och vitaminrelaterade gränsfall

Reducerat vitamin K är kofaktor för γ-glutamylkarboxylas i endoplasmatiskt retikel. Enzymet omvandlar utvalda glutamatrester till γ-karboxyglutamat i koagulationsfaktorerna II, VII, IX och X samt proteinerna C, S och Z. De två karboxylatgrupperna binder Ca²⁺, vilket gör att proteinerna kan associera med negativt laddade fosfolipidmembran och samlas i funktionella koagulationskomplex.

Under karboxyleringen oxideras vitamin K-hydrokinon till epoxid. VKOR återför epoxiden till reducerbart vitamin K. Warfarin hämmar VKOR och minskar successivt mängden funktionellt γ-karboxylerade proteiner. Effekten avspeglas tidigt i förlängd protrombintid och förhöjt INR, särskilt genom den kortare cirkulationstiden för faktor VII. Samtidig hämning av proteinerna C och S bidrar till den initiala protrombotiska fasen vid behandlingsstart.

Askorbat håller järnet reducerat som Fe²⁺ i flera 2-oxoglutaratberoende dioxygenaser, däribland prolyl- och lysylhydroxylaser i kollagensyntesen. Utan askorbat fastnar järnet i en oxiderad, mindre katalytiskt aktiv form. Brist ger nedsatt hydroxylering, instabilt kollagen, blödningar och försämrad sårläkning.

Alla vitaminderivat är inte koenzymer. Retinal är kromofor i opsiner och omvandlar ljusenergi till en strukturell signal. Retinoinsyra och vitamin D verkar huvudsakligen som ligander till nukleära receptorer och reglerar transkription. De är biologiskt aktiva vitaminmetaboliter men inte typiska enzymkofaktorer.

Icke-vitaminhärledda organiska kofaktorer

Flera centrala kofaktorer syntetiseras endogent och är inte direkt beroende av ett vitaminprekursorintag.

Heme innehåller järn i en porfyrinring och används i cytokromer, katalas, peroxidaser och cytokrom P450. Järn–svavelkluster växlar mellan oxidationstillstånd och överför vanligen en elektron i taget. Lipoamid har en reversibelt reducerbar disulfid och fungerar som en rörlig arm i dehydrogenaskomplex. Ubikinon tar upp två elektroner och två protoner men kan även förekomma som semikinon och kopplar därmed olika elektronöverföringssteg i andningskedjan.

BH4 behövs av fenylalanin-, tyrosin- och tryptofanhydroxylas samt kväveoxidsyntas. SAM överför vanligen en metylgrupp men kan i radikal-SAM-enzymer klyvas så att en mycket reaktiv radikal bildas. PAPS sulfaterar bland annat hormoner och xenobiotika, medan UDP-socker driver glykosylering och polysackaridsyntes. ATP kan överföra γ-fosfat, adenylat eller andra aktiverade grupper och ska därför inte reduceras till enbart ”energivaluta”.

Metallkofaktorernas katalytiska principer

Metalljonens funktion bestäms av oxidationstal, koordinationsgeometri och ligandmiljö. Histidins imidazol, cysteins tiolat och karboxylatgrupperna i aspartat och glutamat är vanliga proteinligander. Vatten eller hydroxid kan komplettera koordinationssfären. Tetraedrisk, oktaedrisk eller mer förvrängd geometri påverkar vilka substrat som kan bindas och hur reaktiva de blir.

Som Lewis-syror drar metalljoner elektrontäthet från bundna ligander. Zn²⁺ i karbanhydras sänker pKa för koordinerat vatten från omkring 10 till omkring 7, så att en nukleofil hydroxidjon finns tillgänglig vid fysiologiskt pH. Mg²⁺ stabiliserar fosfatanjoner och minskar elektrostatisk repulsion vid nukleotidreaktioner. Metalljonen kan också stabilisera en negativt laddad övergångsform eller orientera substrat för en närmast linjär nukleofil substitution.

Mg²⁺ och Zn²⁺ är redoxinerta under fysiologiska förhållanden och används främst för Lewis-syrakatalys och laddningskontroll. Fe och Cu kan däremot växla oxidationstal och överföra elektroner. Denna reaktivitet är nödvändig i andning och oxygenaskemi men riskfylld: dåligt kontrollerat Fe eller Cu kan reagera med peroxider och bidra till hydroxylradikaler och oxidativ vävnadsskada.

Metallbindningsställen är selektiva men inte ofelbara. Felmetallering kan ge ett inaktivt eller onormalt reaktivt enzym om exempelvis Zn²⁺ ersätter en avsedd Fe- eller Mn-jon. Affinitet, tillgänglighet, oxidationstillstånd och metallchaperoner avgör vilken metall som faktiskt införs i cellen; den jon som binder starkast i ett provrör är därför inte nödvändigtvis den fysiologiska kofaktorn.

Viktiga metaller och representativa metalloenzymer

ATP förekommer fysiologiskt huvudsakligen som ett Mg–ATP-komplex i enzymreaktioner. Nukleinsyrapolymeraser använder ofta två metalljoner: den ena aktiverar 3′-OH-gruppen för attack, den andra stabiliserar den avgående pyrofosfatgruppen. Zn²⁺ i metalloproteaser polariserar peptidens karbonyl och aktiverar vatten för hydrolys.

Fe i cytokromer växlar mellan Fe²⁺ och Fe³⁺. I cytokrom c-oxidas samverkar hemejärn och kopparcentra för att överföra elektroner till syre och reducera det till vatten. Lysyloxidas är kopparberoende och initierar tvärbindning av kollagen och elastin. Mn-superoxiddismutas i mitokondriematrix omvandlar superoxid till väteperoxid och syrgas.

Molybden sitter i molybdopterin, inte som fri jon. Koboltens biologiska huvudroll hos människa är i kobalamin. Nickelberoende ureas är centralt hos flera mikroorganismer men saknar motsvarande human enzymfunktion. Selen bör avgränsas från metallkofaktorer: selenocystein inkorporeras genetiskt i polypeptidkedjan och är en aminosyra i exempelvis glutationperoxidas, inte en löst bunden metalljon.

Cellulär homeostas, kompartmentering och fysiologisk variation

Kofaktortillgänglighet bestäms av intestinal absorption, plasmatransport, cellupptag, intracellulär omvandling och organellimport. Vattenlösliga vitaminer cirkulerar fria eller proteinbundna och har varierande vävnadsdepåer. B12 kräver intrinsic factor, ileal absorption och specifika transportproteiner. Folat och tiamin måste omvandlas till aktiva intracellulära former, varför normal prekursorhalt inte alltid innebär normal koenzymfunktion.

Järn transporteras av transferrin och lagras främst i ferritin. Koppar transporteras och distribueras genom specifika chaperoner; ceruloplasmin fungerar bland annat som ferroxidas men är inte ett enkelt mått på all biologiskt tillgänglig koppar. Metallotionein binder särskilt zink och koppar och begränsar fria metalljoner. Den fria cytosoliska koncentrationen av redoxaktiva metaller hålls mycket låg för att förhindra ospecifik bindning och radikalbildning.

Kompartmenteringen är funktionell. NADH som bildas i cytosolen överför sina reduktionsekvivalenter till mitokondrien via skyttelsystem, eftersom NADH inte fritt passerar det inre mitokondriemembranet. NADPH produceras och används i särskilda cytosoliska, mikrosomala och mitokondriella pooler. Heme- och Fe–S-syntes är nära knutna till mitokondrierna, medan många γ-karboxylerings- och glykosyleringsreaktioner sker i endoplasmatiskt retikel respektive Golgiapparat.

Behov och laboratoriefynd varierar med kost, ålder, graviditet, inflammation, malabsorption samt njur- och leverfunktion. Inflammation omfördelar järn genom hepcidin och höjer ferritin oberoende av järndepåernas storlek. Njursvikt påverkar utsöndringen av flera vitaminer och metaller, medan leversjukdom stör lagring, transportproteiner och koenzymregenerering. Genetiska defekter i transportörer eller chaperoner kan ge intracellulär brist trots till synes acceptabel serumkoncentration.

Brist, toxicitet och sjukdomsmekanismer

Tiaminbrist hämmar pyruvatdehydrogenas, α-ketoglutaratdehydrogenas och transketolas. Pyruvat omdirigeras mot laktat, ATP-produktionen minskar och energikrävande vävnader som hjärna och myokard drabbas tidigt. Kliniskt ses bland annat Wernickes encefalopati, perifer neuropati, hjärtsvikt och laktacidos. Glukostillförsel kan öka tiaminbehovet och förvärra den metabola blockaden hos svårt bristande patienter.

Folat- och B12-brist ger störd tymidylat- och purinsyntes med megaloblastär anemi. B12-brist ger dessutom neurologisk skada och metylmalonatansamling. B6-brist påverkar neurotransmittorsyntes, transaminering och hemsyntes och kan ge kramper, neuropati eller sideroblastisk anemi. Vid biotinidasbrist kan biotin inte effektivt frigöras och återanvändas, vilket leder till multipel karboxylasbrist med metabol acidos och neurologiska symtom.

Överskott är också skadligt. Järn- och kopparansamling driver oxidativ stress och organskada. Vid hereditär hemokromatos ger otillräcklig hepcidinreglering ökat järnupptag med lever-, pankreas-, hjärt- och ledpåverkan. Wilsons sjukdom beror på ATP7B-defekt med nedsatt biliär kopparutsöndring; Menkes sjukdom orsakas av ATP7A-defekt och ger bristande koppartransport till vävnader. Uttalad zinkexponering kan inducera intestinalt metallotionein och därigenom orsaka sekundär kopparbrist.

Laboratoriediagnostik, läkemedel och experimentella felkällor

Direkt mätning av vitamin eller metall visar inte alltid funktionell tillgänglighet. Plasma-B12 kan vara normalt trots intracellulär brist, medan metylmalonat och homocystein speglar blockerade B12-beroende reaktioner. Homocystein stiger även vid folat- och B6-brist och påverkas av njurfunktion. Erytrocyttransketolas med eller utan tillsatt TPP kan användas som funktionellt mått på tiaminstatus. Protrombintid eller INR avspeglar vitamin K-beroende koagulationsfunktion men påverkas också av leversjukdom och koagulationsfaktorbrist.

Hemolys frisätter intracellulärt magnesium, järn och enzymer och kan ge falskt förhöjda resultat. Inflammation höjer ferritin och ceruloplasmin som akutfasreaktanter. Totalhalter av starkt proteinbundna ämnen påverkas av albumin och andra transportproteiner. Ljus och värme kan bryta ned vissa vitaminer, medan fördröjd separation av plasma kan tillåta fortsatt metabolism. EDTA-kontamination kelaterar divalenta katjoner och kan ge falskt lågt kalcium, magnesium eller zink. Ex vivo-oxidation förändrar redoxkänsliga analyter och kräver snabb, standardiserad provhantering.

Flera läkemedel griper direkt in i kofaktorberoende reaktioner:

• Warfarin blockerar VKOR och därmed vitamin K-cykeln.
• Metotrexat hämmar dihydrofolatreduktas och minskar reducerade folatformer.
• 5-fluorouracil bildar via FdUMP ett stabilt komplex med tymidylatsyntas och 5,10-metylen-THF.
• Isoniazid kan ge funktionell B6-brist genom reaktion med pyridoxal.
• Lustgas oxiderar kobalamin och kan utlösa funktionell B12-inaktivering.
• Metformin är associerat med sänkt B12-status vid långtidsbehandling.
• Metallkelatorer som används vid koppar- eller järnöverskott kan också orsaka brist eller binda andra metaller.

Vid experimentella enzymanalyser måste buffertens metallinnehåll, pH, syresättning och redoxmiljö kontrolleras. Ett apoenzym kan oavsiktligt aktiveras av spårmetaller i reagens, medan fosfat, citrat eller EDTA kan binda den avsedda metallkofaktorn. Rekombinant uttryck kan ge felmetallering eller otillräcklig infästning av heme, Fe–S-kluster eller flavin. Aktivitet bör därför bedömas tillsammans med kofaktorstökiometri, proteinmängd och lämpliga negativa kontroller.

Källor

• Enzyme
• Enzym
• Enzyme