Virologisk diagnostik: metoder och tolkning

Sammanfattning

Virologisk diagnostik bygger på tre frågor: vad ska påvisas, i vilket prov och vid vilken tidpunkt? Nukleinsyrapåvisning med PCR eller annan nukleinsyraamplifiering är förstahandsmetod vid de flesta akuta virusinfektioner. Antigentest ger snabbare svar men har vanligen lägre känslighet. Serologi påvisar värdens immunsvar och används främst för genomgången infektion, immunitetsbedömning eller infektioner där viremin är kortvarig. Virusodling, mikroskopi, immunhistokemi, in situ-hybridisering och sekvensering har mer specialiserade indikationer.

Ett laboratorieresultat är inte liktydigt med sjukdom. Ett positivt PCR-resultat visar att viralt genom finns i provet, men behöver inte innebära aktiv replikation, smittsamhet eller att viruset orsakar patientens symtom. Ett negativt resultat utesluter inte infektion om provet är taget från fel anatomisk lokal, för tidigt eller sent, med otillräcklig provmängd eller efter bristfällig transport. Ct-värden från kvalitativa PCR-metoder ska inte jämföras mellan analysplattformar och bör inte ensamma styra smittsamhetsbedömning eller behandling.

All tolkning ska integrera sannolikheten före provtagning, sjukdomsfas, immunstatus, vaccinationer, tidigare infektioner, provmaterial, metodens validerade användningsområde och möjliga korsreaktioner. Vid ett oväntat resultat bör man i första hand granska dessa faktorer, samråda med klinisk mikrobiolog och vid behov ta ett nytt prov eller använda en metod som påvisar en annan biologisk markör.

Kliniska frågeställningar

Virologisk diagnostik används för flera skilda ändamål:

• fastställa orsaken till ett akut kliniskt syndrom
• avgöra om en infektion är aktuell, tidigare genomgången eller latent
• bedöma antiviral behandlingseffekt
• följa virusreplikation hos immunsupprimerade patienter
• identifiera antiviral resistens
• bedöma smittsamhet eller behov av vårdhygieniska åtgärder
• fastställa immunitet efter infektion eller vaccination
• diagnostisera kongenital infektion
• typa virus för prognos, smittspårning eller epidemiologisk övervakning

Samma analys kan inte besvara alla dessa frågor. Ett positivt antikroppstest kan exempelvis styrka tidigare exposition men säger sällan om viruset finns i luftvägarna samma dag. En kvalitativ PCR kan styrka att nukleinsyra påvisats men är inte automatiskt en validerad kvantitativ virusmätning.

Diagnostisk strategi

Utgå från syndrom, lokal och sjukdomsfas

Provtagningen bör riktas mot den anatomiska lokal där viruset sannolikt replikerar vid den aktuella tidpunkten. Vid luftvägsinfektion används i regel ett övre luftvägsprov tidigt i förloppet. Vid svår pneumoni och negativt övre luftvägsprov kan prov från nedre luftvägarna vara mer relevant. Vid encefalit analyseras cerebrospinalvätska, men blod, serum, luftvägsprov, feces eller vävnad kan behöva komplettera beroende på misstänkt virus. Skillnaden mellan analytisk känslighet och klinisk känslighet är central: även en mycket känslig analys blir kliniskt otillräcklig om provmaterialet inte innehåller virus [1].

Provtagningstekniken har mätbar betydelse. I en systematisk översikt av 106 studier och drygt 60 000 parade prov var vanliga salivprov och nasala prov i genomsnitt 12 procentenheter mindre känsliga än nasofarynxprov vid SARS-CoV-2-RT-PCR. Orofarynxprov var 17 procentenheter mindre känsliga. Däremot hade gurgelprov och saliv efter harkling jämförbar känslighet, men evidensen hade betydande metodologiska begränsningar [2]. Resultaten kan inte direkt överföras till alla luftvägsvirus, men illustrerar att metod, provlokal och provtagningsteknik måste betraktas som en sammanhängande diagnostisk kedja.

Tidpunkten avgör vilken biologisk markör som är mest informativ. Nukleinsyra och antigen kan vanligen påvisas tidigt, medan specifika antikroppar utvecklas senare. Efter den akuta fasen kan nukleinsyra kvarstå trots att odlingsbart virus inte längre kan påvisas. Hos immunsupprimerade patienter kan både viruskinetik och antikroppssvar avvika kraftigt från det förväntade [3].

flowchart TD
A["Definiera frågan<br>aktuell infektion, immunitet<br>eller uppföljning"] --> B["Välj anatomisk lokal<br>och provmaterial"]
B --> C["Bedöm tid från exposition<br>och symtomdebut"]
C --> D["Misstänkt akut infektion"]
C --> E["Sen eller genomgången infektion"]
C --> F["Monitorering eller resistens"]
D --> G["PCR eller annan NAAT<br>eventuellt antigentest"]
E --> H["Serologi<br>eventuellt PCR som komplement"]
F --> I["Kvantitativ NAAT<br>eller sekvensering"]
G --> J["Tolka mot klinik<br>provkvalitet och sannolikhet"]
H --> J
I --> J
J --> K["Oväntat eller inkongruent svar"]
K --> L["Samråd med laboratoriet<br>nytt prov eller alternativ metod"]

När ska prov tas om?

Upprepad provtagning är motiverad när:

• sannolikheten för infektion är hög trots negativt prov
• det första provet kan ha tagits innan virusmängden blivit påvisbar
• provmaterial eller provtagningsteknik varit suboptimala
• infektionen kan ha förflyttats från övre till nedre luftvägar
• ett serologiskt fönster misstänks
• ett svagt positivt eller gränsnära resultat inte överensstämmer med kliniken
• serokonversion eller titerstegring behöver dokumenteras
• en kvantitativ trend ska bekräftas innan behandlingen ändras

Ett nytt prov bör om möjligt tas från den mest relevanta lokalen och inte bara upprepa samma felkälla.

Provmaterial och preanalytik

Provtagning

Provtagningsanvisningen för den specifika analysen ska följas. Ett material som fungerar för PCR behöver inte vara validerat för antigenpåvisning, odling eller sekvensering. Kontrollera särskilt:

• typ av provpinne och transportmedium
• minsta provvolym
• om provet ska kylförvaras
• tillåten transporttid
• om provet får frysas
• om formalinfixerat material accepteras
• om helblod, plasma och serum är utbytbara
• om testet kräver celler, fritt virus eller båda

Otillräckligt cellinnehåll i ett slemhinneprov kan ge falskt negativt resultat. Intern kontroll i en molekylär analys kan visa att extraktion och amplifiering fungerat, men bevisar inte alltid att rätt anatomisk lokal provtagits.

Virusodling kräver i regel snabbare transport och bättre bevarad virusviabilitet än PCR. HSV är känsligt för uttorkning, temperatur och pH. PCR har högre känslighet och är mindre beroende av bibehållen viabilitet, men även nukleinsyra kan brytas ned vid olämplig förvaring [4].

Val av prov vid vanliga syndrom

Biosäkerhet och kontakt med laboratoriet

Vid misstanke om högpatogent, ovanligt eller anmälningspliktigt virus ska laboratoriet kontaktas före provtagning och transport. Det gäller bland annat misstänkta hemorragiska febrar, vissa zoonoser och agens som kräver särskild inneslutning. Laboratoriet avgör lämpligt provmaterial, emballage, transportväg och vilka analyser som kan göras säkert. Svensk hantering styrs av nationella smittskyddsregler och lokala laboratorieanvisningar, vilka kan avvika från internationella publikationer.

Direkta påvisningsmetoder

Nukleinsyraamplifiering

NAAT omfattar PCR, RT-PCR för RNA-virus och andra amplifieringsmetoder. Realtids-PCR är vanligast. Amplifieringen följs kontinuerligt med fluorescens och kan rapporteras kvalitativt eller kvantitativt.

Fördelar:

• hög analytisk känslighet och specificitet
• snabbare svar än odling
• möjlighet till multiplexanalys
• möjlighet till typning och kvantifiering
• kräver inte levande virus

Begränsningar:

• påvisar nukleinsyra, inte nödvändigtvis replikationskompetent virus
• känslig för kontamination och provförväxling
• sekvensvariation kan påverka primer eller prob och ge falskt negativt resultat
• inhibitorer kan hämma extraktion eller amplifiering
• mycket hög känslighet kan påvisa kliniskt irrelevant utsöndring
• ett negativt resultat begränsas av provlokal och tidpunkt

Multipla genetiska mål minskar sårbarheten för mutationer och ger stöd vid oväntade resultat. Vid ett resultat där bara ett av flera mål påvisas bör laboratoriets tolkningsalgoritm följas. Det kan röra sig om låg virusmängd, genetisk variation, ospecifik signal eller kontamination.

Andra nukleinsyraamplifierande tekniker omfattar bland annat TMA och LAMP. I en Cochraneöversikt av alternativa molekylära metoder för SARS-CoV-2 hade TMA en sammanvägd känslighet på 97,6 procent och specificitet på 99,4 procent. RT-LAMP hade 88,4 respektive 99,7 procent, medan RT-LAMP utan konventionell RNA-extraktion hade lägre känslighet, 73,1 procent. Resultaten varierade mellan fabrikat och många studier hade hög risk för systematiska fel [5]. Metodnamnet är därför inte tillräckligt för att bedöma ett tests prestanda.

Multiplex-PCR

Multiplexpaneler analyserar flera virus, ibland även bakterier, samtidigt. De är särskilt användbara när symtombilden är ospecifik och ett snabbt etiologiskt svar påverkar isolering, antiviral behandling eller antibiotikaanvändning.

Begränsningar:

• panelen påvisar bara inkluderade mål
• fler mål ökar sannolikheten för oväntade bifynd
• samtidig påvisning av flera agens bevisar inte att samtliga bidrar till sjukdomen
• kvarstående nukleinsyra kan feltolkas som aktuell infektion
• negativa resultat kan skapa falsk trygghet för agens som inte ingår

För influensa har antigenmetoder och direkt immunfluorescens historiskt haft lägre känslighet än RT-PCR, medan odling tar för lång tid för de flesta akuta behandlingsbeslut [6]. För humant metapneumovirus är PCR känsligare än odling och immunfluorescens, och virusets långsamma tillväxt gör odling olämplig för rutinmässig akutdiagnostik [7]. Dessa erfarenheter har bidragit till att multiplex-NAAT blivit standard vid många luftvägssyndrom.

Kvantitativ PCR och virusmängd

Kvantitativa analyser rapporteras vanligen som IU/ml eller kopior/ml. De används framför allt för:

• HIV-RNA
• HBV-DNA
• HCV-RNA
• CMV-DNA
• EBV-DNA i utvalda situationer
• BK-polyomavirus-DNA efter transplantation

Kvantifiering kräver en validerad kalibrering och ett definierat linjärt mätområde. Resultat under kvantifieringsgränsen kan vara påvisade men inte tillförlitligt mätbara. Små variationer ska inte övertolkas. För HCV kan förändringar mindre än 0,5 log10 IU/ml motsvara analytisk variation snarare än verklig biologisk förändring [8].

Vid monitorering bör samma provtyp, analysplattform och laboratorium användas när det är möjligt. Helblod och plasma kan ge olika nivåer och är inte automatiskt utbytbara. En enstaka nivå bör tolkas tillsammans med trend, behandling, immunstatus och organpåverkan.

Ct-värde

Ct är det antal amplifieringscykler som krävs innan fluorescenssignalen passerar analysens tröskel. Ett lägre Ct-värde motsvarar vanligen mer målnukleinsyra i det analyserade provet. Ct är emellertid inte en direkt och universell virusmängd.

Ct påverkas av:

• provmängd och provtagningsteknik
• anatomisk provlokal
• tidpunkt i sjukdomsförloppet
• transport och förvaring
• extraktionsmetod
• provvolym som tillförs reaktionen
• målgen, primer och prob
• instrument, reagens och tröskelinställning
• förekomst av inhibitorer
• om resultatet normaliserats mot cellmängd

Kvalitativa PCR-metoder är validerade för påvisat eller ej påvisat, inte för kvantitativ jämförelse. Ct-värden från olika plattformar eller olika målgener kan därför inte jämföras direkt. Ett högt Ct-värde kan motsvara låg virusmängd, men även provtagning sent i förloppet, nedbrutet material eller signal nära analysens detektionsgräns. Ett lågt Ct-värde talar för mer nukleinsyra men bevisar inte ensamt smittsamhet eller sjukdomsgrad [9].

Antigenpåvisning

Antigentest påvisar virala proteiner med exempelvis lateralflödesteknik, enzymimmunanalys eller kemiluminiscens. De ger ofta svar inom 10 till 30 minuter och kan användas nära patienten.

Antigentest fungerar bäst när virusmängden är hög. De har i regel hög specificitet men lägre känslighet än NAAT. I en metaanalys av SARS-CoV-2-tester nära patienten var den sammanvägda känsligheten 70,6 procent och specificiteten 98,9 procent för antigentest. Motsvarande resultat för molekylära snabbtester var 92,8 respektive 97,6 procent [10]. Antigentestens känslighet sjönk tydligt hos asymtomatiska personer och efter den första sjukdomsveckan.

Ett positivt antigentest vid typiska symtom och hög prevalens har ofta högt positivt prediktivt värde. Ett negativt test utesluter däremot inte infektion vid stark klinisk misstanke. IDSA:s riktlinje för SARS-CoV-2 anger att de flesta positiva antigentest kan användas utan molekylär bekräftelse, medan negativt test vid fortsatt misstanke bör följas av NAAT eller upprepad antigentestning [11]. Principen är relevant även för andra antigenbaserade snabbtest, men den exakta algoritmen måste följa det aktuella testets validering.

Virusodling

Vid virusodling inokuleras prov i mottagliga celler och bedöms med cytopatisk effekt, antigenfärgning eller molekylär konfirmation. Odling visar att replikationskompetent virus fanns i det undersökta provet, men ett negativt odlingsresultat utesluter inte viabelt virus eftersom metoden har begränsad känslighet.

Rutinmässig odling har ersatts av NAAT för många virus. Den används fortfarande vid:

• fenotypisk resistensbestämning
• karakterisering av nya eller ovanliga virus
• referensdiagnostik
• forskning och epidemiologisk övervakning
• särskilda frågeställningar om replikationskompetens

Vid genital HSV är PCR betydligt känsligare än odling. Odlingskänsligheten minskar från färska vesikler till läkande eller krustabelagda lesioner, och negativ odling utesluter därför inte HSV [4].

Immunfluorescens

Direkt eller indirekt immunfluorescens påvisar viralt antigen i celler. Metoden kan ge snabbt svar och samtidigt visa om provet innehåller tillräckligt med epitelceller. Den kräver erfaren bedömare och är vanligen mindre känslig än PCR. Den har numera främst en kompletterande roll eller används där molekylär diagnostik saknas.

Elektronmikroskopi

Elektronmikroskopi kan visualisera viruslika partiklar men har låg känslighet, kräver hög viruskoncentration och är svårtolkad. Cellorganeller kan felaktigt tolkas som virus. Metoden rekommenderas inte som rutinmässig primärdiagnostik och bör reserveras för expertlaboratorier [12].

Indirekt diagnostik med serologi

Principer

Serologi påvisar specifika antikroppar, oftast IgM, IgG, totalantikroppar eller funktionellt neutraliserande antikroppar. Resultatet påverkas av tid från infektion, tidigare expositioner, vaccination, immunstatus och testets antigenmål.

IgM ska tolkas försiktigt

IgM är inte en universell markör för akut primärinfektion. Falskt positivt IgM kan orsakas av korsreaktiva antikroppar, reumatoid faktor, heterofila antikroppar eller polyklonal B-cellsaktivering. Vid HSV kan IgM förekomma både vid primärinfektion och reaktivering och rekommenderas därför inte för rutinmässig klassificering av genital herpes [4].

I en studie av fyra SARS-CoV-2-serologiska analyser hade IgM eller IgA-baserade test lägre specificitet än IgG-test. Falskt positiva resultat sågs särskilt i serum från patienter med serologiska tecken på Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia psittaci eller Legionella pneumophila [13]. Ett oväntat isolerat IgM-resultat bör därför bekräftas med nytt prov, alternativ analys eller direkt viruspåvisning.

Serokonversion, titerstegring och aviditet

Serokonversion mellan akutprov och konvalescentprov är starkare evidens för nylig infektion än ett enstaka positivt prov. Provintervallet måste anpassas till virusets antikroppskinetik, ofta omkring två till fyra veckor.

IgG-aviditet beskriver hur starkt antikropparna binder antigen. Låg aviditet kan stödja nylig primärinfektion, medan hög aviditet talar för att infektionen ligger längre tillbaka. Metoden är användbar i särskilda frågeställningar, exempelvis vid oklar EBV-serologi eller bedömning av primärinfektion under graviditet. Resultatet måste tolkas med analysspecifika gränser.

Vid EBV talar kombinationen VCA-IgM positivt, VCA-IgG positivt och EBNA-1-IgG negativt vanligen för primärinfektion. VCA-IgG tillsammans med EBNA-1-IgG utan VCA-IgM talar för tidigare infektion. Isolerade markörer eller samtidig positivitet för alla tre kan kräva aviditet, immunoblot, uppföljningsprov eller EBV-DNA [14].

Korsreaktioner

Korsreaktion är särskilt betydelsefull mellan närbesläktade virus. Flavivirusserologi kan påverkas av tidigare dengue, zikavirus, TBE-virus, gula febern eller vaccination mot flavivirus. Under de första sjukdomsdagarna bör molekylär diagnostik prioriteras när viremi kan förväntas. Senare används serologi, ibland med neutralisationstest som bekräftelse [15].

Vid arbovirusencefalit är viremin ofta kort och serologi därför vanligare än PCR. Ett positivt förstahandstest kan behöva bekräftas med neutralisation, serokonversion eller minst fyrfaldig titerstegring i parade serumprov [16].

Tolkning av vanliga resultatmönster

Positiv PCR

Ett positivt PCR-resultat kan innebära:

• akut symtomgivande infektion
• presymtomatisk eller asymtomatisk infektion
• långvarig utsöndring efter genomgången infektion
• latent eller intermittent reaktiverad infektion
• kontamination
• kliniskt irrelevant bifynd

Sannolikheten för kausalitet ökar om fyndet kommer från rätt anatomisk lokal, sammanfaller tidsmässigt med sjukdomen, förekommer i relevant mängd och passar med syndromet. Kausaliteten är svagare för virus som ofta persisterar eller utsöndras asymtomatiskt.

För EBV är blod-PCR användbar för monitorering i vissa transplantationssammanhang, men ett positivt resultat i blod eller likvor bevisar inte ensamt EBV-orsakad organsjukdom. Vid EBV-associerad tumör är påvisning av EBER i tumörceller med in situ-hybridisering mer direkt kopplad till vävnadsdiagnosen [17].

Negativ PCR

Kontrollera:

1. Var rätt provmaterial valt?
2. Var provet taget i rätt sjukdomsfas?
3. Var provmängden tillräcklig?
4. Fungerade intern kontroll?
5. Kan sekvensvariation ha påverkat analysen?
6. Har antiviral behandling minskat virusmängden?
7. Behövs annan lokal eller indirekt diagnostik?

Vid misstänkt HSV-encefalit är PCR i cerebrospinalvätska förstahandsmetod. Ett tidigt negativt prov kan behöva upprepas vid kvarstående stark misstanke. Intratekal antikroppsanalys kan vara ett senare komplement. Positiv PCR för lymfotropa herpesvirus i likvor kräver särskilt försiktig kausalitetstolkning [18].

Diagnostik av virusinfektion i centrala nervsystemet försvåras av att viruskoncentrationen kan vara låg i likvor och att den mest infekterade vävnaden inte är tillgänglig för provtagning [19].

Positiv serologi men negativ PCR

Detta kan tala för:

• genomgången infektion
• sen sjukdomsfas efter avslutad viremi
• vaccination
• falskt positiv serologi
• provtagning från fel lokal för PCR
• infektion där serologi är känsligare än direktpåvisning vid den aktuella tidpunkten

PCR positiv men serologi negativ

Detta kan tala för:

• mycket tidig infektion före serokonversion
• uteblivet antikroppssvar vid immunsuppression
• snabbt insatt antiviral behandling
• ospecifikt eller kontaminerat PCR-resultat
• kvarstående nukleinsyra hos en patient vars antikroppar inte mäts av den valda analysen

Särskilda diagnostiska situationer

Viral hepatit

Hepatitvirus illustrerar behovet av kombinerad direkt och indirekt diagnostik. Vid HCV används anti-HCV som expositionsmarkör och HCV-RNA för att fastställa aktuell infektion. Antikroppar kan dröja 34 till 70 dagar hos immunokompetenta och ännu längre vid HIV. Vid misstänkt akut HCV bör därför HCV-RNA analyseras även om anti-HCV är negativt [8].

Vid HBV bör grundprofilen omfatta HBsAg, total anti-HBc och anti-HBs. HBsAg talar för aktuell infektion, anti-HBc visar naturlig exposition och anti-HBs kan bero på vaccination eller genomgången infektion. Vaccination ger anti-HBs men inte anti-HBc. Isolerat anti-HBc kan motsvara utläkt infektion med sjunkande anti-HBs, fönsterfas, ockult infektion eller falsk reaktivitet. HBV-DNA behövs vid oklar profil, immunsuppression och behandlingsmonitorering [8].

Inför betydande immunsuppression räcker det inte att fråga efter känd hepatit. HBsAg och anti-HBc bör analyseras eftersom även utläkt HBV kan reaktiveras. HBV-DNA används för riskbedömning och uppföljning [20].

HIV

Modern HIV-screening använder kombinerad antigen och antikroppsanalys. Ett reaktivt screeningprov ska alltid verifieras enligt laboratoriets konfirmationsalgoritm. Vid misstänkt mycket tidig infektion, diskrepanta konfirmationsresultat eller påverkan av preexpositionsprofylax kan HIV-RNA behövas [21]. Fjärde generationens test kan förkorta det diagnostiska fönstret till omkring 14 dagar, men ett negativt tidigt prov måste relateras till senaste exposition och följas upp när det är indicerat [22].

Kongenital CMV

Kongenital CMV diagnostiseras genom CMV-DNA i saliv eller urin inom de första 21 levnadsdagarna. Efter denna tidpunkt kan postnatal infektion inte säkert skiljas från kongenital infektion [23]. Positivt salivprov bör bedömas enligt lokal konfirmationsrutin, eftersom kontamination med maternellt virus kan förekomma. Serologi hos det nyfödda barnet är inte tillräcklig för diagnos eftersom maternellt IgG passerar placenta.

Immunsuppression och transplantation

Hos immunsupprimerade patienter är ett negativt antikroppstest mindre tillförlitligt och reaktivering av latenta virus vanligare. Kvantitativ NAAT används för att följa CMV, EBV och BK-polyomavirus, men trösklar är metodberoende.

För BK-polyomavirus efter njurtransplantation är plasma-DNA bättre kopplat till nefropatirisk än virus i urin. Ett värde över 10 000 kopior/ml har använts som stöd för presumtiv BK-virusnefropati, men internationell analysstandardisering är otillräcklig. Histologi är fortfarande referensmetod, och sjukdomens fokala utbredning kan ge falskt negativ biopsi [24].

Sekvensering och vävnadsdiagnostik

Riktad sekvensering

Sekvensering används för:

• virusgenotyp och subtyp
• antiviral resistens
• utbrottsanalys och smittkedjor
• påvisning av diagnostisk målförlust
• identifiering av nya varianter
• karakterisering av ovanliga fynd

Genotypisk resistensbestämning påvisar kända mutationer. Den kan inte alltid förutsäga fenotypen, särskilt om mutationens kliniska betydelse är oklar eller resistenta varianter utgör en liten andel av viruspopulationen. Resultatet måste tolkas mot behandlingsexponering, virusmängd och etablerade resistensdatabaser.

Metagenomisk sekvensering

Metagenomisk nästa generations sekvensering, mNGS, analyserar i princip allt DNA och RNA i provet utan att en specifik patogen måste anges i förväg. Metoden är mest användbar vid svår, oförklarad infektion när riktade analyser varit negativa, särskilt i normalt sterila prov.

Fördelar:

• bred agensdetektion i ett enda prov
• möjlighet att identifiera oväntade eller nya virus
• mindre beroende av odlingsbarhet
• kan samtidigt ge typningsinformation

Begränsningar:

• låg mängd viralt material kan döljas av humant DNA
• RNA-virus kräver anpassad provberedning
• kontamination och normalflora kan ge svårtolkade fynd
• rapporteringströsklar är inte standardiserade
• negativt svar utesluter inte infektion
• kräver bioinformatik och klinisk expertgranskning

NGS används kliniskt som helgenomsekvensering, riktad metagenomik eller bred metagenomik. Bred metagenomik kan identifiera virus, bakterier, svampar och parasiter direkt från prov, men värdens nukleinsyra och den normala mikrobiotan reducerar känsligheten [25]. I en metaanalys av 20 studier var sammanvägd känslighet 75 procent och specificitet 68 procent, med mycket stor heterogenitet [26].

I en prospektiv multicenterstudie av 204 patienter med meningit eller encefalit diagnostiserades 58 infektioner. mNGS identifierade 13 infektioner som inte hittats vid det lokala sjukhusets konventionella testning, men missade bland annat infektioner som endast kunde diagnostiseras serologiskt, från annan vävnad eller vid mycket låg patogenmängd i likvor [27]. mNGS bör därför komplettera, inte ersätta, riktad PCR, serologi och prov från relevant vävnad.

Immunhistokemi och in situ-hybridisering

Immunhistokemi lokaliserar viralt antigen i vävnad. In situ-hybridisering lokaliserar viral nukleinsyra till specifika celler. Dessa metoder är särskilt värdefulla när kausalitet kräver att viruset visas i den skadade eller neoplastiska cellpopulationen.

PCR på vävnad kan vara känsligare men visar inte vilka celler som innehåller viruset. Formalinfixering, ischemitid och autolys kan försämra nukleinsyra och antigen. Elektronmikroskopi är tidskrävande och riskerar morfologisk feltolkning. I jämförande vävnadsstudier av SARS-CoV-2 har RNA-baserade metoder varit mer robusta än immunhistokemi, medan in situ-hybridisering gett möjlighet till cellulär lokalisering [12].

Praktisk resultattolkning

Sannolikhet före och efter test

Positivt och negativt prediktivt värde påverkas av prevalens och klinisk sannolikhet. Vid låg sannolikhet kan en liten falskt positiv andel ge fler falska än sanna positiva resultat. Vid hög sannolikhet kan ett negativt test vara otillräckligt för att utesluta infektion.

Exempel: om en analys har 99 procents specificitet och används hos 1 000 personer där endast en verkligen är infekterad, kan omkring tio falskt positiva resultat uppstå för varje sant positivt resultat. Samma test får ett betydligt högre positivt prediktivt värde under ett utbrott [15].

Diskrepanta resultat

Vid diskrepans mellan klinik och laboratorium:

1. verifiera patientidentitet, provtid och provmaterial
2. kontrollera sjukdomsfas och tidigare behandling
3. bedöm om fyndet kan bero på vaccination eller tidigare infektion
4. fråga laboratoriet om signalstyrka, gränsvärde och interna kontroller
5. överväg kontamination, korsreaktion eller sekvensvariation
6. ta om provet från samma eller bättre lokal
7. använd en metod med annan princip eller annan målsekvens
8. värdera alternativa infektiösa och icke-infektiösa diagnoser

Ett laboratoriefynd bör väga tyngst när det biologiskt besvarar den kliniska frågan. Direktpåvisning från sjuk vävnad är vanligen starkare stöd för kausalitet än seropositivitet i blod. Serokonversion är starkare stöd för nylig infektion än isolerat IgM. En reproducerbar kvantitativ trend är mer informativ än ett enstaka lågt positivt värde.

Kvalitetssäkring och svarskommunikation

Laboratoriet ska validera analysen för angivet provmaterial och användningsområde. Kvalitetssäkring omfattar positiva, negativa och interna kontroller, åtgärder mot kontamination, deltagande i extern kvalitetskontroll och övervakning av sekvensvariation som kan påverka diagnostiska mål.

Ett användbart svar bör, när relevant, ange:

• virus och eventuell typ
• påvisat, ej påvisat eller gränsvärde
• provmaterial
• kvantitativ nivå och enhet
• detektionsgräns och kvantifieringsgräns
• om resultatet ligger utanför linjärt mätområde
• om analysen är validerad för aktuell provtyp
• viktiga tolkningsbegränsningar
• rekommendation om nytt prov eller konfirmation

Klinikern bör på remissen ange symtomdebut, exponering, resa, vaccination, graviditet, immunstatus, transplantation, antiviral behandling och relevant syndrom. Dessa uppgifter kan påverka både val av analys och hur laboratoriet granskar ett oväntat resultat.

Källor

1. Tang YW m.fl. Laboratory Diagnosis of COVID-19: Current Issues and Challenges. Journal of Clinical Microbiology 2020. PMID: 32245835
2. Davenport C m.fl. The effect of sample site and collection procedure on identification of SARS-CoV-2 infection. Cochrane Database of Systematic Reviews 2024. PMID: 39679851
3. Safiabadi Tali SH m.fl. Tools and Techniques for Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 SARS-CoV-2/COVID-19 Detection. Clinical Microbiology Reviews 2021. PMID: 33980687
4. LeGoff J m.fl. Diagnosis of genital herpes simplex virus infection in the clinical laboratory. Virology Journal 2014. PMID: 24885431
5. Arevalo-Rodriguez I m.fl. Laboratory-based molecular test alternatives to RT-PCR for the diagnosis of SARS-CoV-2 infection. Cochrane Database of Systematic Reviews 2024. PMID: 39400904
6. Kim DK, Poudel B. Tools to detect influenza virus. Yonsei Medical Journal 2013. PMID: 23549796
7. Hermos CR m.fl. Human metapneumovirus. Clinics in Laboratory Medicine 2010. PMID: 20513544
8. Prasidthrathsint K, Stapleton JT. Laboratory Diagnosis and Monitoring of Viral Hepatitis. Gastroenterology Clinics of North America 2019. PMID: 31046974
9. Punchoo R m.fl. Laboratory Considerations for Reporting Cycle Threshold Value in COVID-19. EJIFCC 2022. PMID: 36313906
10. Fragkou PC m.fl. Performance of point-of care molecular and antigen-based tests for SARS-CoV-2: a living systematic review and meta-analysis. Clinical Microbiology and Infection 2023. PMID: 36336237
11. Hayden MK m.fl. The Infectious Diseases Society of America Guidelines on the Diagnosis of COVID-19: Antigen Testing. Clinical Infectious Diseases 2024. PMID: 36702617
12. von Stillfried S, Boor P. Detection methods for SARS-CoV-2 in tissue. Der Pathologe 2021. PMID: 33770236
13. Huber T m.fl. Diagnostic performance of four SARS-CoV-2 antibody assays in patients with COVID-19 or with bacterial and non-SARS-CoV-2 viral respiratory infections. European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases 2021. PMID: 34109500
14. De Paschale M, Clerici P. Serological diagnosis of Epstein-Barr virus infection: Problems and solutions. World Journal of Virology 2012. PMID: 24175209
15. Musso D, Despres P. Serological Diagnosis of Flavivirus-Associated Human Infections. Diagnostics 2020. PMID: 32423058
16. Piantadosi A, Kanjilal S. Diagnostic Approach for Arboviral Infections in the United States. Journal of Clinical Microbiology 2020. PMID: 32938736
17. Gulley ML, Tang W. Laboratory assays for Epstein-Barr virus-related disease. Journal of Molecular Diagnostics 2008. PMID: 18556771
18. Boivin G. Diagnosis of herpesvirus infections of the central nervous system. Herpes 2004. PMID: 15319090
19. Lipkin WI, Hornig M. Diagnostics and Discovery in Viral Central Nervous System Infections. Brain Pathology 2015. PMID: 26276023
20. Mak JWY m.fl. Prevention and management of hepatitis B virus reactivation in patients with hematological malignancies in the targeted therapy era. World Journal of Gastroenterology 2023. PMID: 37731995
21. Williams E m.fl. Laboratory diagnosis of HIV: a contemporary overview in the Australian context. Pathology 2023. PMID: 37302942
22. Bolduc P m.fl. Care of Patients With HIV Infection: Diagnosis and Monitoring. FP Essentials 2016. PMID: 27092562
23. Gaur P m.fl. Is it not time for international guidelines to combat congenital cytomegalovirus infection? A review of central nervous system manifestations. Clinical Radiology 2020. PMID: 32216960
24. Al-Talib M m.fl. BK Polyomavirus-associated nephropathy: diagnostic and treatment standard. Nephrology Dialysis Transplantation 2025. PMID: 39794277
25. Hilt EE, Ferrieri P. Next Generation and Other Sequencing Technologies in Diagnostic Microbiology and Infectious Diseases. Genes 2022. PMID: 36140733
26. Liu J m.fl. Diagnostic accuracy of metagenomic next-generation sequencing in diagnosing infectious diseases: a meta-analysis. Scientific Reports 2022. PMID: 36470909
27. Wilson MR m.fl. Clinical Metagenomic Sequencing for Diagnosis of Meningitis and Encephalitis. New England Journal of Medicine 2019. PMID: 31189036