DNA-virus

DNA-virus omfattar flera evolutionärt skilda viruslinjer med dubbel- eller enkelsträngade genom och orsakar allt från akut cytolytisk infektion till livslång latens, kronisk hepatit och malignitet. Genomstruktur, replikationslokal och beroende av värdcellens DNA-maskineri bestämmer i hög grad vävnadstropism, patogenes, diagnostik och känslighet för antivirala läkemedel.

Definition och avgränsning

DNA-virus är virus vars genom utgörs av deoxiribonukleinsyra. Begreppet beskriver genomtyp och replikationsstrategi, inte en gemensam morfologi eller ett enskilt evolutionärt taxon. Gruppen är polyfyletisk: olika DNA-viruslinjer har sannolikt uppkommit vid flera tillfällen och kan ha helt skilda kapsidproteiner, polymeraser och replikationsmekanismer.

I Baltimoreklassifikationen indelas virus efter hur de producerar mRNA. Tre grupper är relevanta:

Grupp VII räknas funktionellt till omvänt transkriberande virus snarare än till de klassiska grupperna I och II. Hepatit B-virus, HBV, har DNA i virionen men replikerar via pregenomiskt RNA och omvänt transkriptas. DNA-virus ska också skiljas från RNA-virus, vars ärftliga material är RNA, och från DNA-vacciner, där en plasmid används som läkemedelsplattform för att uttrycka ett antigen men inte utgör ett virus.

Genom, kapsid och hölje

DNA-genom kan vara linjära eller cirkulära och enkel- eller dubbelsträngade. Linjära genom behöver särskilda lösningar på ändreplikationsproblemet. Exempel är inverterade terminala repetitioner, kovalent slutna hairpin-ändar och terminalproteiner som fungerar som primer. Adenovirus har ett linjärt dsDNA med inverterade terminala repetitioner och ett protein kovalent bundet till vardera 5′-änden. Parvovirus har terminala hairpin-strukturer, medan poxvirus har kovalent slutna hairpin-ändar.

Små genom utnyttjar ofta överlappande läsramar, alternativ splitsning och multifunktionella proteiner. Virus-DNA kan föreligga som en extrakromosomal episom, som integrerat DNA eller i båda formerna. Herpesvirus kvarstår vanligen episomalt under latens. HPV-genom bibehålls ofta episomalt vid produktiv infektion men kan integreras vid cancerutveckling. HBV bildar stabilt, kovalent slutet cirkulärt DNA, cccDNA, i hepatocytkärnan och kan dessutom integrera fragment av virus-DNA i värdgenomet.

Herpesvirusets tegument ligger mellan kapsiden och lipidhöljet och innehåller regulatoriska proteiner som levereras direkt till cytoplasman vid infektion. Poxvirus saknar konventionell ikosaedral symmetri och har en flerskiktad komplex morfologi. Höljet gör i regel virus känsligare för uttorkning, detergenter och alkohol, vilket gynnar nära kontakt, dropp- eller kroppsvätskesmitta. Icke-höljeförsedda adenovirus och parvovirus är mer miljöstabila och kan lättare spridas via kontaminerade ytor, vatten eller fekal–oral smitta.

Klassifikation, evolution och värdspektrum

Baltimoreklassifikationen är funktionell och beskriver vägen från genom till mRNA. ICTV:s taxonomi försöker i stället återge evolutionära samband med hjälp av bland annat konserverade kapsidveck, replikationsproteiner och genompackningssystem. Ett virus kan därför vara nära ett annat i Baltimoreklassifikationen men långt ifrån det fylogenetiskt.

DNA-virusens evolution är modulär. Kapsid-, replikations- och värdinteraktionsgener kan ha skilda ursprung och har kombinerats genom rekombination och horisontell genöverföring. Särskilt små ssDNA-virus anses vid upprepade tillfällen ha utvecklats ur plasmidliknande replikoner. Värdgener kan förvärvas och modifieras till virala homologer som hämmar interferon, apoptos, komplement eller antigenpresentation.

DNA-virus infekterar bakterier, arkéer, protister, svampar, växter och djur. Bakteriofager reglerar bakteriepopulationer och förmedlar transduktion. Geminivirus och andra växtvirus orsakar betydande skördeförluster, medan exempelvis afrikanskt svinpestvirus och olika herpesvirus har stor veterinärmedicinsk betydelse. Jättelika nukleocytoplasmatiska DNA-virus, bland annat mimivirus hos protister, kan ha genom på mer än en megabas och påverkar marina näringsvävar genom värdlys och omfördelning av organiskt material.

Replikationscykel – från receptorbindning till frisättning

Infektionen inleds genom bindning mellan virala kapsidproteiner eller höljeglykoproteiner och en eller flera cellulära receptorer. Receptortillgång är nödvändig men inte alltid tillräcklig för tropism; koreceptorer, proteaser, endocytosvägar och intracellulära restriktionsfaktorer måste också vara kompatibla. Höljeförsedda virus penetrerar vanligen genom fusion vid plasmamembranet eller efter endocytos. Icke-höljeförsedda virus genomgår receptorutlösta kapsidförändringar som möjliggör endosomal escape.

Efter avklädning transporteras många kapsider eller nukleoproteinkomplex längs mikrotubuli med dynein mot kärnporen. Genomet förs därefter in i kärnan, där de flesta humana DNA-virus replikerar. Poxvirus är det viktigaste undantaget och genomför både transkription och genomreplikation i cytoplasmatiska virusfabriker.

Genuttrycket är ofta temporalt organiserat. Immediate-early-proteiner omprogrammerar cellen och aktiverar följande virala gener. Early-proteiner omfattar DNA-polymeras, nukleotidmetabola enzymer och immunmodulatorer. Först efter genomreplikationen uttrycks late-gener för kapsid-, tegument- och höljesproteiner. Värdcellens RNA-polymeras II transkriberar de flesta nukleära DNA-virus; cytoplasmatiskt replikerande poxvirus måste föra med eller koda ett eget transkriptionssystem.

Nya kapsider monteras i kärna eller cytoplasma, fylls med genom och mognar genom proteolys och strukturella omlagringar. Icke-höljeförsedda virus frisätts ofta genom celllys. Höljeförsedda virus knoppar genom cellulära membran och kan lämna cellen via exocytos. Produktivitet avgörs även av cellens tillgång till deoxiribonukleotider, replikationsfaktorer och energi samt av interferoninducerade antivirala proteiner.

Genomreplikationens olika mekanismer

Vid bidirektionell theta-replikation öppnas ett cirkulärt eller cirkulariserat genom vid ett replikationsorigin. Två replikationsgafflar rör sig i motsatta riktningar och syntetiserar ledande och släpande sträng. Papillomvirus använder denna princip vid episomunderhåll, medan herpesvirus kan övergå från originberoende syntes till en rolling-circle-liknande fas som producerar konkatemerer för kapsidpackning.

Vid rolling-circle-replikation klyver ett endonukleas ena DNA-strängen och skapar en fri 3′-OH-grupp. DNA-polymeras förlänger denna ände samtidigt som den tidigare strängen trängs undan. Rolling-hairpin-replikation hos parvovirus använder i stället terminala hårnålar som vecklas om och fungerar som självpåbyggande primerstrukturer. Eftersom ssDNA inte är ett lämpligt substrat för konventionell mRNA-transkription måste inkommande ssDNA först omvandlas av cellulära polymeraser till en dubbelsträngad replikativ form.

Adenovirus använder proteinprimad strand-displacement-syntes. Ett preterminalt protein fungerar som primer och förblir kovalent bundet till den nybildade 5′-änden, medan den motsatta strängen förskjuts och senare kopieras. Herpesvirus kodar ett eget DNA-polymeras men är fortfarande beroende av kärnans miljö och flera cellulära faktorer. Poxvirus kodar däremot polymeras, transkriptionsenzymer och ett omfattande maskineri för helt cytoplasmatisk replikation.

HBV avviker genom att kärnans cccDNA transkriberas till bland annat pregenomiskt RNA. Detta RNA packas tillsammans med polymeraset i en omogen kapsid, där omvänd transkription producerar minussträngs-DNA och därefter en ofullständig plussträng. DNA-virus har vanligen lägre substitutionshastighet än RNA-virus, men variationen är betydande. Polymerastyp, 3′–5′-exonukleasbaserad korrekturläsning, exponerat ssDNA och användning av omvänt transkriptas påverkar mutationsfrekvensen.

Cellcykel, vävnadstropism och cytopatologi

Små DNA-virus har begränsad kodningskapacitet och saknar ofta egna enzymer för nukleotidsyntes och DNA-replikation. De måste därför infektera celler i S-fas eller själva aktivera cellcykeln. HPV E7 frigör E2F genom att inaktivera retinoblastomprotein, medan polyomvirusens T-antigen har motsvarande cellcykeldrivande funktion. Stora herpes- och poxvirus kodar fler egna polymeras-, kinas- och nukleotidmetabola funktioner och kan replikera i mindre proliferativa celler.

Parvovirus B19 använder globosid, P-antigen, och andra inträdesfaktorer och replikerar effektivt i erytroida prekursorer med aktiv DNA-syntes. HPV:s produktiva replikation är kopplad till skivepitelets differentiering: basalceller upprätthåller episomet, medan genomamplifiering och kapsidproduktion sker högre upp i epitelet. Herpesvirus uppvisar skilda tropismer; HSV och VZV är neurotropa under latens, EBV är B-cellstropiskt och CMV etablerar latens i myeloida progenitorer och monocytära celler.

Cytopatologin omfattar cellavrundning, kromatinkondensering, celllys, syncytiebildning och kärn- eller cytoplasmainklusioner. Herpesvirus ger typiskt intranukleära inklusioner och multinukleära celler. Poxvirus kan ge cytoplasmatiska inklusionskroppar. Papillomvirus orsakar koilocytos och proliferativa lesioner snarare än snabb lys, medan adenovirus kan ge kraftig kärnförstoring och lytisk vävnadsskada.

Antiviral immunitet och immunflykt

Felplacerat eller strukturellt avvikande DNA känns framför allt igen av cGAS, som producerar den cykliska dinukleotiden cGAMP. cGAMP aktiverar STING på endoplasmatiska retiklet, vilket via TBK1 och IRF3 inducerar typ I-interferon. TLR9 känner igen DNA i endosomer, särskilt ometylerade CpG-motiv. DNA och virusorsakad cellskada kan dessutom aktivera inflammasomer med mognad av interleukin-1β och interleukin-18.

Typ I-interferon inducerar ett stort antal interferonstimulerade gener som hämmar inträde, transkription, proteinsyntes och virionmontering. NK-celler begränsar tidigt celler med stressligander eller nedreglerat MHC klass I. Neutraliserande antikroppar blockerar extracellulära virioner, medan CD8-positiva T-celler är centrala för eliminering av infekterade celler och kontroll av herpesvirus, polyomvirus och HBV.

DNA-virus kodar ett omfattande immunflyktsmaskineri. Virala proteiner kan blockera cGAS–STING, interferonproduktion, JAK–STAT-signalering, peptidtransport till MHC klass I, apoptos och komplement. Herpes- och poxvirus kodar även cytokin- eller cytokinreceptorliknande proteiner. Immunsuppression ändrar därför sjukdomsbilden dramatiskt: CMV kan ge pneumonit, kolit och retinit; VZV disseminerad infektion; adenovirus multiorgansjukdom; BK-virus nefropati efter njurtransplantation; och JC-virus progressiv multifokal leukoencefalopati, PML.

Persistens, latens, integration och reaktivering

Latens innebär att virusgenomet kvarstår med starkt begränsat genuttryck utan kontinuerlig virionproduktion. Detta skiljer sig från låggradigt produktiv persistens, där virus bildas intermittenta eller kontinuerligt, och från kronisk replikation med varaktigt detekterbart virus och fortgående vävnadsskada. Samma virus kan växla mellan dessa tillstånd beroende på celltyp och immunläge.

HSV-1, HSV-2 och VZV kvarstår som episomer i sensoriska neuron. EBV etablerar episomal latens i B-celler, medan CMV:s latenta reservoar finns i myeloida progenitorer och monocyter. HPV persisterar i basala epitelceller. BK- och JC-virus kvarstår efter primärinfektionen, bland annat i urinvägar och njure, och reaktiveras framför allt vid nedsatt cellulär immunitet.

HBV:s cccDNA är en stabil nukleär episom som fortsätter att fungera som transkriptionsmall trots suppression av serum-HBV-DNA. Integrerat HBV-DNA kan uttrycka vissa proteiner men producerar vanligen inte komplett virus. Reaktivering kan utlösas av T-cellsdepletion, transplantation, cytostatika, anti-CD20-behandling, högdossteroider, graviditetsrelaterad immunmodulation, inflammation eller vävnadsskada. Klinisk reaktivering kan ge allt från asymtomatisk DNA-stegring till fulminant organsjukdom.

Herpesviridae

Herpesvirus är höljeförsedda dsDNA-virus med ikosaedral kapsid och tegument. Samtliga etablerar livslång latens men skiljer sig i replikationshastighet, latenscell och kliniskt syndrom.

HSV kan ge svår neonatal infektion med hud–ögon–mun-sjukdom, encefalit eller disseminerad multiorgansjukdom. VZV ger vid primärinfektion vattkoppor och vid reaktivering bältros; immunsupprimerade riskerar pneumonit, hepatit och encefalit. Kongenital CMV kan orsaka sensorineural hörselnedsättning, mikrocefali, intrakraniella förkalkningar och tillväxthämning. Efter transplantation är CMV-pneumonit, enterokolit och benmärgspåverkan viktiga komplikationer.

EBV-infektion ger ofta mononukleos hos ungdomar och är associerad med bland annat Burkittlymfom, Hodgkinlymfom, posttransplantationslymfoproliferativ sjukdom och nasofarynxcancer. HHV-8 är nödvändigt för Kaposis sarkom men sjukdomsrisken styrs starkt av immunstatus. HHV-6B kan reaktiveras efter hematopoetisk stamcellstransplantation och associeras då bland annat med encefalit.

Diagnostiken baseras på PCR, serologi, antigenemi, histopatologi eller immunhistokemi beroende på virus och syndrom. Aciklovir måste fosforyleras av viralt tymidinkinas och är därför effektivt mot HSV och VZV men betydligt mindre aktivt mot CMV. Ganciklovir aktiveras vid CMV bland annat av UL97-kinas. Resistens uppkommer ofta genom förändringar i UL97, medan mutationer i DNA-polymerasgenen UL54 kan ge resistens mot ganciklovir och korsresistens mot andra polymerashämmare.

Adenoviridae

Adenovirus är icke-höljeförsedda ikosaedrala virus med linjärt dsDNA. Fiberproteinernas terminala knoppar binder cellulära receptorer, varefter pentonbasens interaktion med integriner främjar endocytos. Replikationen sker i kärnan genom proteinprimad strand displacement. Viruset kan efter primärinfektion kvarstå länge i lymfoid vävnad, särskilt tonsiller och adenoider.

Kliniken varierar med typ och smittväg. Adenovirus orsakar faryngit, bronkit och pneumoni, faryngokonjunktival feber, epidemisk keratokonjunktivit, gastroenterit och hemorragisk cystit. Utbrott förekommer i förskolor, vårdmiljöer, simbassänger och tätt boende populationer. Icke-höljeförsedd struktur medför relativ motståndskraft mot uttorkning och flera rutinmässigt använda desinfektionsförhållanden.

Hos patienter efter stamcells- eller organtransplantation kan infektionen bli disseminerad med pneumonit, hepatit, enterit, nefrit, cystit och encefalit. PCR måste tolkas utifrån provmaterial, klinik, virusmängdens förändring, adenovirustyp och immunkompetens. Ett lågt fynd i luftvägsprov hos barn kan spegla långvarig utsöndring, medan stigande DNA-nivå i plasma hos en stamcellstransplanterad patient kan förebåda invasiv sjukdom.

Papillomaviridae, Polyomaviridae och DNA-virusinducerad cancer

Onkogena HPV-typer driver cellcykeln genom E6 och E7. E6 främjar nedbrytning av p53, vilket försämrar DNA-skaderespons och apoptos. E7 binder retinoblastomprotein och frigör E2F, så att cellen går in i S-fas. Vid integration av högrisk-HPV störs ofta E2, en negativ regulator av E6/E7, vilket kan ge ihållande onkogenexpression och klonal expansion.

HPV-6 och HPV-11 orsakar främst kondylom och respiratorisk papillomatos och betraktas som lågrisktyper. HPV-16 och HPV-18 står för en stor andel HPV-relaterad cancer. Det är framför allt persisterande högriskinfektion, inte ett enstaka positivt test, som driver cervikal, vulvär, vaginal, anal, penil och orofaryngeal carcinogenes. Progression kräver vanligen långvarig infektion och ackumulation av cellulära genetiska och epigenetiska förändringar.

BK-virus reaktiveras främst efter njurtransplantation och kan ge tubulointerstitiell nefrit med graftdysfunktion; efter hematopoetisk transplantation förekommer hemorragisk cystit. JC-virus infekterar oligodendrocyter vid uttalad eller selektivt nedsatt cellulär immunitet och orsakar PML. Merkelcellspolyomavirus är klonalt integrerat i en stor andel Merkelcellscarcinom; tumörerna uttrycker trunkerade T-antigen som behåller tillväxtdrivande men förlorar virusreplikativa funktioner.

Cancerutveckling vid DNA-virusinfektion kan alltså bero på virala onkoproteiner, klonal integration, kronisk inflammation eller nedsatt immunövervakning. EBV, HHV-8 och HBV utgör ytterligare viktiga exempel. Påvisat virus-DNA i en tumör visar dock inte ensamt att viruset är kausalt; lokalisation, transkript- eller proteinuttryck, integrationsmönster och epidemiologiskt samband måste vägas in.

Poxviridae

Poxvirus är stora höljeförsedda dsDNA-virus med komplex morfologi. Eftersom replikationen sker i cytoplasman måste virionen medföra ett RNA-polymeras och andra enzymer som krävs innan nya virusproteiner hunnit bildas. Genomreplikation, transkription och montering sker i avgränsade cytoplasmatiska virusfabriker. Genomet har terminala hairpin-strukturer och produceras via konkatemeriska intermediärer som måste upplösas till enhetsgenom.

Variolavirus, som orsakade smittkoppor, hade människan som enda reservoar och utrotades genom global vaccination; eradikering förklarades 1980. Sjukdomen gav hög feber och ett centrifugalt utslag vars lesioner inom ett kroppsregion vanligen befann sig i samma utvecklingsstadium. Mpoxvirus har däremot zoonotisk epidemiologi och sprids genom nära hudkontakt, kroppsvätskor, kontaminerat material och i vissa situationer luftvägssekret. Lesionerna utvecklas från makula och papel till vesikel, pustel och krusta och kan kompliceras av proktit, bakteriell superinfektion, pneumonit eller encefalit.

Molluscum contagiosum ger fasta, glansiga, centralt navlade papler och är vanligen självläkande hos barn och immunkompetenta vuxna. Utbredda eller terapiresistenta lesioner kan vara tecken på immunsuppression. Vacciniabaserade smittkoppsvacciner ger korsimmunitet mot mpox men levande replikerande vacciner kräver särskild riskbedömning vid immunbrist, graviditet och svår atopisk dermatit. Tecovirimat hämmar poxvirusproteinet VP37 och därmed bildning och spridning av höljeförsedda extracellulära virioner.

ssDNA-virus, hepatit B-virus och övriga kliniskt viktiga familjer

Parvovirus B19 binder globosid, P-antigen, och infekterar erytroida prekursorer. Lytisk infektion stoppar erytropoesen tillfälligt. Hos barn ger infektionen erythema infectiosum med typiskt kinderytem och senare retikulärt exantem; vuxna, särskilt kvinnor, kan få uttalad symmetrisk artrit eller artralgi. Hos patienter med hög erytrocytomsättning kan det kortvariga produktionsstoppet utlösa aplastisk kris, medan immunsupprimerade kan utveckla kronisk ren erytrocytaplasi och anemi.

Vid maternell infektion kan fetal anemi, hjärtsvikt och hydrops fetalis uppkomma. Diagnostiken baseras på IgM/IgG och PCR, men immunsupprimerade kan sakna adekvat antikroppssvar. Humana bocavirus påvisas framför allt i luftvägsprov hos barn, ofta tillsammans med andra agens, vilket försvårar kausal tolkning. Dependoparvovirus, där adenoassocierade virus ingår, behöver ett hjälparvirus eller särskilda cellulära betingelser för effektiv produktiv replikation och används även som vektorer i genterapi.

Anelloviridae omfattar små cirkulära ssDNA-virus som är mycket vanliga i människans virom. Virusmängden påverkas av immunstatus, men någon specifik kausal sjukdom är inte säkert etablerad. Ett positivt fynd ska därför inte automatiskt tillskrivas klinisk betydelse.

HBV är ett höljeförsett hepatotropiskt virus med partiellt dubbelsträngat cirkulärt DNA. Efter kärnimport repareras genomet till cccDNA. Cellulärt RNA-polymeras II producerar virala mRNA och pregenomiskt RNA, vilket omvänt transkriberas inne i nukleokapsiden. Leverskadan är huvudsakligen immunmedierad snarare än direkt cytolytisk. Kronisk infektion kan genom ihållande inflammation, regeneration, integrationshändelser och virala proteiners effekter leda till fibros, cirros och hepatocellulär cancer.

Klinisk diagnostik, prevention och antiviral behandling

Valet av metod måste utgå från infektionens fas och anatomiska lokal. Nukleinsyraamplifiering är förstahandsmetod vid många akuta CNS-, luftvägs-, genitala och disseminerade infektioner. Kvantitativ PCR används för att följa CMV, EBV, BK-virus, adenovirus och HBV. Vid misstänkt encefalit analyseras likvor, vid keratit kornealt material, vid kongenital CMV saliv eller urin tidigt efter födelsen och vid vävnadsinvasiv sjukdom ofta biopsi utöver blodprov.

Negativt virus-DNA är det förväntade referensfyndet i de flesta kliniska prov, men frånvaro i blod utesluter inte lokaliserad vävnadsinfektion eller latens. Låga DNA-nivåer och höga Ct-värden måste tolkas försiktigt. Ct-värden är inte direkt jämförbara mellan laboratorier, instrument, extraktionsmetoder eller provmaterial. Gränser för preemptiv behandling efter transplantation är därför patientgrupps-, metod- och centrumsspecifika.

Serologi är särskilt värdefull vid EBV-, parvovirus B19-, VZV- och HBV-infektion, men måste tolkas som en markörprofil. Vid kongenital infektion kan maternellt IgG komplicera bedömningen. Histopatologi och immunhistokemi kan påvisa vävnadsinvasion vid exempelvis CMV, adenovirus och polyomavirus, medan resistensgenotypning är motiverad vid stigande virusmängd trots adekvat exponering för antiviralt läkemedel.

Vaccination kan förebygga HPV-relaterad cancer och kondylom, varicella och herpes zoster, hepatit B samt smittkopps-/mpoxsjukdom hos definierade riskgrupper. HBV-vaccin är dessutom ett cancerpreventivt vaccin genom att det förhindrar kronisk hepatit och därmed minskar risken för hepatocellulär cancer. Vaccinskydd eliminerar inte behovet av screening eller klinisk diagnostik enligt gällande program.

Antiviral behandling riktas ofta mot viruskodade polymeraser. Aciklovir och närbesläktade nukleosidanaloger hämmar herpesvirus-DNA-polymeras efter fosforylering. Ganciklovir och valganciklovir används mot CMV men kan ge benmärgssuppression. Foscarnet binder pyrofosfatstället på DNA-polymeras utan att kräva fosforylering och kan användas vid vissa kinasmutationer, men medför betydande nefrotoxicitet och elektrolytrubbningar. Cidofovir är en nukleotidanalog med aktivitet mot flera DNA-virus; brincidofovir är en lipidkonjugerad analog med annorlunda farmakologi.

Letermovir hämmar CMV:s terminaskomplex och används framför allt som profylax i särskilda transplantationssituationer. Tecovirimat riktas mot poxvirusets VP37. Vid HBV hämmar nukleos(t)idanaloger omvänd transkription och suppressar virusreplikationen men eliminerar sällan cccDNA. Resistens kan orsakas av förändrad kinasaktivering, modifierat polymerasmål eller förändrade replikationsproteiner. Vid PML, BK-virusinfektion och flera andra opportunistiska DNA-virusinfektioner är minskad immunsuppression eller annan immunrekonstitution ofta den viktigaste åtgärden, även när specifika antivirala alternativ saknas eller har begränsad dokumentation.

Källor

• DNA virus
• DNA-virus
• DNA virus
• Bild: File:Virus dsDNA.svg — Franciscosp2, CC BY-SA 3.0
• Bild: File:Virus ssDNA.svg — Franciscosp2, CC BY-SA 3.0
• Bild: File:Human DNA viruses implicated in carcinogenesis.png — Mmeshkatian, CC0