Autoantikroppar i klinisk praxis

Autoantikroppar ska tolkas som sannolikhetsmodifierande biomarkörer i en definierad klinisk kontext, inte som diagnoser i sig. Korrekt användning kräver kännedom om antigenmål, analysmetod, titer eller koncentration, sjukdomsspecificitet, interferenser och vilka antikroppar som faktiskt kan följas över tid.

Klinisk användning: från frågeställning till post-test-sannolikhet

Autoantikroppar används diagnostiskt, klassificerande och ibland prognostiskt. Ett fynd kan stödja en klinisk diagnos, bidra till uppfyllda klassifikationskriterier, identifiera en sjukdomssubtyp eller ange risk för exempelvis nefrit, interstitiell lungsjukdom, trombos eller fetal komplikation. Antikroppen är däremot sällan en fristående diagnos: både friska personer och patienter med infektion, malignitet eller annan autoimmun sjukdom kan vara positiva.

Tolkningen börjar med pretest-sannolikheten, det vill säga sannolikheten för sjukdom före provsvaret. Den baseras på symtom, status, sjukdomsduration, epidemiologi och andra laboratoriefynd. Raynauds fenomen med sklerodaktyli, patologisk nagelbandskapillärbild och reflux ger exempelvis en helt annan pretest-sannolikhet för systemisk skleros än isolerad trötthet.

Beräkningen sker via odds: pretest-odds = sannolikhet/(1−sannolikhet), post-test-odds = pretest-odds × likelihoodkvot och post-test-sannolikhet = post-test-odds/(1+post-test-odds). Som matematiskt exempel ger 10 % pretest-sannolikhet och LR+ 10 en post-test-sannolikhet på cirka 53 %. Samma test vid 1 % pretest-sannolikhet ger endast cirka 9 % post-test-sannolikhet.

Bred screening vid ospecifika symtom skapar därför många falskt positiva fynd. ANA kan förekomma hos cirka 5–30 % av friska beroende på gränsvärde, metod och population. När sjukdomen är sällsynt i den testade gruppen kan antalet positiva friska överstiga antalet sant positiva sjuka, även för ett test med god specificitet. Beställningen bör därför formuleras utifrån en klinisk hypotes, inte som en generell ”autoimmunitetskontroll”.

Immunologiska mekanismer och patogenicitet

Central tolerans eliminerar eller inaktiverar starkt autoreaktiva lymfocyter. B-celler selekteras i benmärgen genom deletion, receptorredigering eller anergi, medan T-celler genomgår negativ selektion i thymus. AIRE-medierat uttryck av vävnadsantigener bidrar till att autoreaktiva T-celler exponeras för självstrukturer redan under utvecklingen.

Perifer tolerans håller kvarvarande autoreaktiva kloner under kontroll genom avsaknad av kostimulering, anergi, apoptos och regulatoriska T-celler. IL-10, TGF-β och inhibitoriska receptorer begränsar aktivering. Autoimmunitet uppstår när flera skyddsnivåer sviktar samtidigt, vanligen genom samverkan mellan HLA-bunden genetisk mottaglighet, miljöexponering, infektion och förändrad immunreglering.

Apoptos exponerar DNA, histoner och ribonukleoproteiner i membranblåsor. Om apoptotiskt material och neutrofilrester inte elimineras effektivt kan nukleinsyror internaliseras av antigenpresenterande celler och stimulera intracellulära receptorer. HLA klass II-molekyler presenterar peptider för autoreaktiva CD4-positiva T-celler, som därefter ger hjälp till B-celler. Molekylär mimikry kan initiera korsreaktivitet mellan mikrobiella och kroppsegna epitoper, medan epitope spreading successivt breddar svaret till fler delar av samma antigenkomplex eller till närliggande antigen.

I germinalcentra genomgår autoreaktiva B-celler som fått T-cellshjälp somatisk hypermutation, affinitetsmognad och klassbyte, ofta till IgG. Resultatet kan bli långlivade plasmaceller och högavida antikroppar. HLA-DR2 och HLA-DR3 är exempel på alleler som associerats med ökad benägenhet till presentation av autoantigen.

Alla autoantikroppar är inte patogena. Anti-Sm fungerar främst som sjukdomsmarkör, medan anti-TSH-receptorantikroppar kan stimulera eller blockera receptorn direkt. Vid SLE bildar nukleära antigen och antikroppar immunkomplex som deponeras i kärl och glomeruli. IgG bundet i komplex aktiverar Fcγ-receptorer på myeloida celler och den klassiska komplementvägen via C1q, vilket leder till C3- och C4-konsumtion, kemotaxi och vävnadsskada. Högavida anti-dsDNA-antikroppar kan dessutom korsreagera med glomerulära strukturer; kombinationen stigande anti-dsDNA, sjunkande komplement och nytillkommen albuminuri inger misstanke om lupusnefrit.

Analysmetoder, provhantering och laboratoriesvar

Serum är standardmaterial för de flesta autoantikroppsanalyser. Provtagningen kräver vanligen ingen fasta, men laboratoriet behöver relevanta uppgifter om diagnosmisstanke, immunsuppression och antikoagulantiabehandling. Hemolys, lipemi, felaktig förvaring och upprepade frys–tiningscykler kan påverka vissa analyser.

Vid IIF anges titern som den högsta serumspädning där reaktiviteten fortfarande kan bedömas positiv, exempelvis 1:160. En förändring från 1:160 till 1:320 är ett spädningssteg och kan ligga inom biologisk eller analytisk variation. Koncentrationer från ELISA eller kemiluminiscens rapporteras däremot i metodspecifika enheter; numeriskt lika svar från olika fabrikat behöver inte representera samma antikroppsmängd.

Antigenkälla, rekombinant uttryck, reningsmetod, fixering, konjugat, instrumentkalibrering och lot påverkar sensitivitet och specificitet. Resultat ska därför jämföras mot det aktuella laboratoriets referensintervall och beslutsgränser. Vid longitudinell uppföljning är samma laboratorium och plattform att föredra.

ANA-screening med HEp-2-celler

Vid indirekt immunfluorescens inkuberas spätt patientserum på fixerade och permeabiliserade HEp-2-celler. Autoantikroppar binder till tillgängliga nukleära, cytoplasmatiska eller mitotiska antigen. Efter tvätt tillsätts fluorescensmärkt anti-humant IgG, överskottet tvättas bort och preparatet granskas i fluorescensmikroskop eller digitalt avläsningssystem.

HEp-2-substratet innehåller ett stort spektrum av antigen och många celler i mitos. Både interfascellernas kärna och metafaskromosomerna måste bedömas, eftersom exempelvis centromer-, kromatin- och mitosapparatmönster skiljs genom färgningen av delande celler. Automatisk bildanalys kan stödja bedömningen, men svaga, ovanliga och blandade mönster kräver erfaren granskning.

Gränsvärdet varierar mellan laboratorier. Omkring 5–30 % av friska kan vara ANA-positiva beroende på population och vald spädning; låg titer är särskilt vanlig hos äldre och kvinnor. ANA har cirka 95–98 % sensitivitet för SLE och är därför användbart som sensitiv ingångsanalys, men den generella specificiteten är låg. Ett negativt korrekt utfört ANA minskar sannolikheten för SLE betydligt, men utesluter inte anti-Ro-dominerad sjukdom eller cytoplasmatisk autoimmunitet.

ANA-mönster enligt ICAP och riktad reflexanalys

ICAP-nomenklaturen beskriver fluorescensens lokalisation och morfologi. Mönstret är en hypotes om antigenmålet, inte en antigenspecifik analys. Samma mönster kan orsakas av flera antikroppar, och samma antikropp kan ge olika utseende beroende på substrat och koncentration.

Blandmönster är vanliga. Ett starkt homogent mönster kan maskera ett svagare kornigt mönster, och antikroppskoncentrationer kan göra att ett mönster framträder först efter ytterligare spädning. Avvikelse mellan IIF-mönster och solid-phase-resultat bör därför inte automatiskt avfärdas som laboratoriefel.

Isolerad anti-DFS70-reaktivitet, utan andra sjukdomsspecifika antikroppar och utan typisk klinik, talar emot systemisk autoimmun reumatisk sjukdom. Fyndet utesluter dock inte sådan sjukdom på egen hand. DFS70 måste verifieras antigenspecifikt eftersom andra finkorniga mönster kan misstolkas som dense fine speckled.

Anti-dsDNA, anti-Sm och ENA-panelen

ENA-paneler innehåller definierade nukleära antigen, men panelernas sammansättning varierar. Ro60 och Ro52 bör särskiljas eftersom de är biologiskt skilda proteiner: Ro60 är ett RNA-bindande protein, medan Ro52/TRIM21 är ett cytoplasmatiskt och nukleärt E3-ubikvitinligasprotein.

Anti-Sm förekommer hos omkring 20 % av patienter med SLE men är mycket specifik; frånvaro utesluter således inte SLE. Anti-dsDNA har metodberoende sensitivitet på ungefär 25–85 %. ELISA och liknande solid-phase-metoder är ofta känsliga men kan fånga lågavida antikroppar med lägre sjukdomsspecificitet.

Crithidia luciliae-IIF använder kinetoplasten, som är rik på nativt dsDNA men saknar många andra nukleära antigen. Metoden har därför hög specificitet för anti-dsDNA men lägre sensitivitet än vissa ELISA-metoder. Diskrepanta resultat kan återspegla skillnader i aviditet och antigenpresentation snarare än att ett av svaren är ”fel”.

Högavida anti-dsDNA-antikroppar är kliniskt mest relevanta vid SLE. Stigande nivåer tillsammans med sjunkande C3/C4, hematuri, cylindrar, albuminuri eller försämrat kreatinin stärker misstanken om aktiv lupusnefrit. Anti-dsDNA ska ändå inte ensamt utlösa behandlingseskalering. ANA-titern korrelerar sämre med aktivitet och bör normalt inte följas seriellt.

Tolkning vid SLE, Sjögrens syndrom och graviditet

Vid misstänkt SLE kombineras ANA med anti-dsDNA, anti-Sm, anti-Ro/SSA, anti-La/SSB och antifosfolipidantikroppar. Blodstatus kan visa leukopeni, lymfopeni eller trombocytopeni. Urinsticka, urinsediment, albuminuri, kreatinin och serumalbumin är centrala för att upptäcka njurengagemang, medan C3 och C4 speglar komplementkonsumtion.

Vid etablerad SLE följs kliniska organmanifestationer snarare än enbart serologi. Anti-dsDNA och komplement kan vara användbara aktivitetsmarkörer, särskilt vid tidigare serologiskt korrelerad nefrit, men deras dynamik varierar mellan patienter. Anti-Sm, anti-Ro och anti-La används huvudsakligen för fenotypning och upprepas sällan.

Sjögrens syndrom bedöms genom siccasymtom, objektiv undersökning av tår- och salivfunktion, anti-Ro/SSA och vid behov spottkörtelbiopsi. Anti-Ro förekommer oftare än anti-La; isolerad anti-La har lägre diagnostiskt värde och bör tolkas med metodkritik. Seropositivitet kan associeras med tidigare debut, parotissvullnad och extraglandulär sjukdom.

Maternella anti-Ro/SSA och anti-La/SSB är IgG-antikroppar som passerar placenta. De kan orsaka neonatal lupus med övergående kutana eller hematologiska manifestationer samt kongenital AV-block genom inflammatorisk och fibrotisk skada i fostrets retledningssystem. Antikroppspositiv graviditet motiverar obstetrisk riskvärdering och riktad fetal övervakning enligt lokalt program, särskilt om kvinnan tidigare fött ett barn med neonatal lupus eller AV-block.

Systemisk skleros, overlap och inflammatorisk myopati

Antikroppsprofilen vid systemisk skleros bidrar till riskstratifiering men ersätter inte organutredning. Anti-centromer associeras främst med begränsad kutan sjukdom och senare risk för pulmonell arteriell hypertension. Anti-topoisomeras I, även kallad Scl-70, associeras med diffusare hudengagemang och interstitiell lungsjukdom. Anti-RNA-polymeras III är kopplad till diffus kutan progression, skleroderm njurkris och tidsmässig association mellan sjukdomsdebut och malignitet.

Myositspecifika antikroppar definierar kliniskt relevanta undergrupper. Antisyntetasantikroppar, däribland Jo-1 mot histidyl-tRNA-syntetas, PL-7 och PL-12, associeras med interstitiell lungsjukdom, myosit, artrit, Raynauds fenomen och mekanikerhänder. Lungmanifestationen kan dominera över muskelsymtomen.

Anti-MDA5 associeras med dermatomyosit, ofta relativt liten muskelenzymstegring och risk för snabbt progredierande interstitiell lungsjukdom. Anti-Mi-2 ses vid klassisk dermatomyosit, anti-TIF1γ och anti-NXP2 motiverar malignitetsvärdering utifrån ålder och klinik, medan anti-SRP och anti-HMGCR associeras med immunmedierad nekrotiserande myopati. Flera mål är cytoplasmatiska; negativt ANA på HEp-2-celler utesluter därför inte inflammatorisk myopati.

Reumatoid artrit: reumatoid faktor och ACPA

Reumatoid faktor, vanligen analyserad som IgM-RF, binder Fc-delen av IgG. ACPA är antikroppar mot citrullinerade proteinepitoper och analyseras ofta som anti-CCP. Båda har jämförbar klinisk sensitivitet i många RA-populationer, men ACPA har högre specificitet.

I klassifikationssammanhang skiljs låg och hög serologisk nivå. Hög RF eller ACPA definieras som mer än tre gånger analysens övre referensgräns. Värdet måste därför bedömas mot laboratoriets egen beslutsgräns, inte mot ett generellt numeriskt normalvärde.

ACPA kan påvisas flera år före klinisk artrit, särskilt hos genetiskt predisponerade rökare, men den absoluta sjukdomsrisken hos en symtomfri individ beror på populationen. Vid ny svullen led ska serologin kombineras med ledstatus, inflammationsmarkörer och bilddiagnostik. Negativ RF och ACPA utesluter inte seronegativ RA.

ANCA vid småkärlsvaskulit

ANCA-diagnostik omfattar IIF och antigenspecifika analyser. c-ANCA innebär huvudsakligen granulär cytoplasmatisk färgning och är oftast kopplad till PR3-ANCA. p-ANCA ger perinukleär färgning efter etanolfixering och är ofta kopplad till MPO-ANCA, men mönster och antigen är inte synonyma.

PR3-ANCA är starkt associerad med granulomatös polyangit, medan MPO-ANCA är vanlig vid mikroskopisk polyangit och förekommer vid eosinofil granulomatös polyangit. Diagnosen kräver en förenlig fenotyp, exempelvis glomerulonefrit, lungkapillarit, destruktiv ÖNH-sjukdom, mononeuritis multiplex eller eosinofil systemsjukdom. Biopsi är ofta värdefull när resultatet påverkar behandling.

Atypisk ANCA förekommer vid inflammatorisk tarmsjukdom, autoimmun leversjukdom, infektion och läkemedelsexponering. ANA kan ge perinukleär eller nukleär interferens och försvåra IIF-tolkningen. Vissa läkemedel kan inducera MPO-dominerade eller multispecifika profiler.

ANCA-nivåer kan förändras med aktivitet men ska inte ensamma styra diagnos, återfallsbedömning eller behandlingseskalering. Ett stigande värde utan kliniska eller laboratoriemässiga tecken på vaskulit har otillräckligt positivt prediktivt värde. Bedömningen bör omfatta organfunktion, urinsediment, kreatinin, inflammationsmarkörer, bilddiagnostik och vid behov histologi.

Antifosfolipidantikroppar och trombosrisk

Laboratorieutredningen omfattar lupusantikoagulans, antikardiolipin IgG/IgM och anti-β2-glykoprotein I IgG/IgM. Lupusantikoagulans påvisas funktionellt med fosfolipidberoende koagulationsanalyser, medan de två övriga analyseras med solid-phase-metoder.

För klassifikationsmässig antifosfolipidpositivitet krävs persisterande fynd i prover tagna med minst 12 veckors mellanrum. Övergående låg positivitet är vanlig vid infektion och ska inte likställas med antifosfolipidsyndrom. Medelhöga till höga antikroppsnivåer, lupusantikoagulans och multipel positivitet väger tyngre än isolerad låg aCL-nivå.

Kliniska manifestationer omfattar venös eller arteriell trombos och definierad obstetrisk morbiditet, såsom upprepade graviditetsförluster, fosterdöd eller placentamedierad prematuritet. Laboratoriefynd utan klinisk manifestation är inte i sig antifosfolipidsyndrom.

Heparin, vitamin K-antagonister och direktverkande orala antikoagulantia kan ge falska eller svårtolkade lupusantikoagulansresultat. Även akut trombos, kraftig inflammation och infektion påverkar bedömningen. Provtagning bör om möjligt planeras tillsammans med koagulationslaboratorium; antikoagulantia ska inte sättas ut utan individuell riskbedömning.

Autoantikroppar vid lever-, gastrointestinal och endokrin sjukdom

Vid autoimmun hepatit typ 1 förekommer ANA och glattmuskelantikroppar, medan anti-LKM1 är typisk för typ 2. Anti-SLA/LP är relativt sjukdomsspecifik och kan förekomma när ANA och glattmuskelantikroppar saknas. Serologin ska vägas samman med transaminaser, IgG, virusdiagnostik, läkemedelsexponering och leverhistologi.

Primär biliär kolangit kännetecknas av kolestatisk leverprovsbild och antimitochondrieantikroppar, främst M2. Anti-gp210 och anti-sp100 kan stödja diagnosen vid AMA-negativ sjukdom; gp210 kan associeras med mer aggressivt förlopp. Antikroppsfynd utan kolestas ska inte ensamt etablera diagnosen.

Vid celiakimisstanke analyseras transglutaminas-IgA tillsammans med total-IgA. Endomysium-IgA kan användas som verifierande analys. Vid IgA-brist behövs IgG-baserade tester. Glutenreduktion före provtagning kan sänka antikroppsnivån och orsaka falskt negativt resultat.

TPO-antikroppar markerar autoimmun tyreoideadestruktion men avgör inte aktuell funktionsgrad; denna fastställs med TSH och fritt T4. Tyreoglobulinantikroppar har kompletterande diagnostisk betydelse och kan interferera med tyreoglobulinmätning. TSH-receptorantikroppar är däremot funktionellt relevanta vid Graves sjukdom och kan användas diagnostiskt samt vid graviditetsrelaterad fetal riskvärdering.

Falskt positiva och falskt negativa resultat

Låggradig autoantikroppspositivitet är vanligare vid hög ålder, kvinnligt kön, graviditet och familjär predisposition. Infektioner, malignitet, kronisk inflammation och organspecifik autoimmunitet kan ge ANA, RF, ANCA-liknande eller antifosfolipidreaktivitet utan motsvarande systemisk reumatisk sjukdom.

Läkemedel kan inducera både antikroppar och kliniska syndrom. Hydralazin och prokainamid associeras med läkemedelsutlöst lupus och anti-histonantikroppar, men anti-histon förekommer även vid idiopatisk SLE. Ett serologiskt fynd utan relevant läkemedelsexponering och kompatibel klinik är därför inte diagnostiskt.

Falsk negativitet kan bero på tidig sjukdom, immunsuppression, låg antikroppskoncentration eller teknisk antigenförlust under fixering. Begränsade multiplexpaneler missar antikroppar mot antigen som inte ingår. Anti-Ro och flera myositantikroppar kan dessutom ge svag eller huvudsakligen cytoplasmatisk färgning och därmed ett negativt eller missvisande ”ANA”-svar.

Heterofila antikroppar och RF kan binda analysreagens och ge falskt höga eller positiva resultat i immunometriska metoder. Prozone- eller hookeffekt kan i vissa system ge oväntat låg signal vid mycket hög antikroppskoncentration. Vid diskrepans mellan klinik och laboratorium bör laboratoriet kontaktas för omanalys, alternativ metod, spädningsstudie eller interferensutredning.

Praktiska beställnings- och tolkningsalgoritmer

Provtagningen bör börja med den kliniskt mest relevanta analysen. Reflexpaneler är rationella när primärresultat och symtombild anger vilka antigen som är sannolika; de bör inte användas som ospecificerad screening.

Vid positiv ANA bör nästa steg bestämmas av mönster och fenotyp. Homogent mönster med nefritmisstanke motiverar anti-dsDNA, komplement och njurprover; centromermönster med Raynaud motiverar systemisk sklerosbedömning; cytoplasmatiskt mönster med muskelsvaghet eller interstitiell lungsjukdom motiverar myositpanel. Negativ ANA ska inte leda till att en starkt underbyggd vaskulit-, myosit- eller organspecifik frågeställning överges.

Upprepning är meningsfull när persistens ingår i definitionen, som för antifosfolipidantikroppar efter minst 12 veckor, eller när förändring har dokumenterat samband med aktivitet, som anti-dsDNA tillsammans med C3, C4, urinstatus, albuminuri och kreatinin vid SLE. ANCA kan följas som ett komplement hos en enskild patient men får inte ensamt styra behandling.

Rutinmässig omkontroll av oförändrad ANA-positivitet saknar vanligen värde. Detsamma gäller upprepade ENA-paneler när en stabil specificitet redan har fastställts. Ny provtagning är motiverad vid tydligt förändrad fenotyp, stark klinisk misstanke trots tidigare negativt test, misstänkt metodproblem eller när resultatet förväntas ändra handläggningen.

Källor

• Antinuclear antibody
• Antinukleära antikroppar
• Antinuclear antibody
• Bild: File:ANA Immunofluorescence.png — Simon Caulton, CC BY-SA 3.0